中药银黄消痤对痤疮丙酸杆菌临床株生物被膜形成和黏附的影响▲

寇 静 连莉阳 张宏方 环 诚 史琳娜 吕蕊花 贺太平

(陕西中医药大学医学技术学院，咸阳市 712046，电子邮箱:78276628@qq.com)

痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes，PA)是一种生长相对缓慢的典型革兰阳性厌氧菌，其与皮肤疾病粉刺的形成息息相关，为痤疮患者毛囊皮脂腺内的优势菌群，被认为是引起痤疮病变的主要微生物，占所有检测到微生物数量的89%[1]。目前认为，微生物参与的致病机制主要与其形成的生物膜相关[2]。当这些病原菌形成生物膜结构时,多糖钙架多聚体构成一个保护性外骨架，形成一个生物膜微环境，使得这些病原菌对宿主细胞的致病性和对抗菌药物的免疫性成倍地增加。PA作为痤疮病灶中的优势菌群，其成膜能力的强弱对痤疮的根治、复发有很大的影响。本课题组前期研究表明，中药银黄消痤对痤疮有一定的治疗作用[3]，但其对痤疮病变中的优势菌群PA生物被膜抑制作用的相关机制，尚缺乏系统的研究报告。本研究探讨中药银黄消痤抑制PA生物被膜的效果，为临床治疗痤疮提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 受试菌株 PA均分离自于陕西中医药大学第一附属医院住院的痤疮患者皮损组织，采用刚果红平板检测杆菌胞间多糖黏附素合成情况，筛选出强产膜PA实验株为受试菌株，置于-80℃冰箱保存。

1.2 试剂 中药银黄消痤为陕西中医药大学第一附属医院自制药剂；TSB培养基(杭州天和微生物试剂有限公司，批号：190607)，MH肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20191202)，刚果红琼脂培养基(杭州天和微生物试剂有限公司，批号：190719)，脑心浸出液(brian heart infusion，BHI)培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：20190716)，普通的营养琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司，批号：190718)；结晶紫染料(上海蓝季科技发展有限公司，批号：760213)。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及菌悬液的制备：将1.1中分离的菌株接种于MH肉汤培养基，37℃进行培养48 h，再用TSB培养基于摇床上37℃厌氧培养48 h二次活化，3 500 r/min离心15 min弃上清，无菌生理盐水洗涤，采用灭菌生理盐水校正菌悬液浓度为吸光度值600=0.1(约0.5麦氏单位，5×108CFU/mL)[4]。

1.3.2 生长动力学检测：参照文献[5]，分别取100 μL配制好的菌悬液接种于含100 μL MH肉汤培养基的96孔板，37℃厌氧环境下培养0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h(每个时间段设6个复孔)后，于酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)590 nm波长处分别测定各孔吸光度值检测菌液浓度；弃去培养液，采用结晶紫染色法观察细菌生物被膜形成情况，在590 nm波长处测定吸光度值，作为生物被黏膜附量。

1.3.3 药品的配制与最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)/最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)的测定：采用96孔微量板二倍稀释法分别测定中药银黄消痤对PA的MIC和MBC。将中药银黄消痤采用二倍稀释法分别配制成终浓度为150 mg/mL、75 mg/mL、37.5 mg/mL、18.75 mg/mL、9.38 mg/mL、4.69 mg/mL、2.34 mg/mL、1.17 mg/mL、0.59 mg/mL、0.29 mg/mL、0.15 mg/mL、0.07 mg/mL的含药营养肉汤，按照所含药物浓度从高到低的顺序分别依次加入96孔微量板,每孔180 μL，另备2孔各加营养肉汤180 μL。将1.3.1制备的PA菌悬液，分别加入微量板含药孔以及1孔营养肉汤(对照孔)中,每孔加20 μL菌悬液,以未加菌悬液的营养肉汤孔为空白孔。将微量板置于厌氧密封袋中,加入厌氧发生袋,封口,37℃厌氧环境下培养72 h，于酶标仪测定590 nm波长处测吸光度值，其中吸光度值无变化的最小药物浓度设为MIC。分别取培养后96孔中培养液50 μL涂布在营养琼脂平板，37℃厌氧环境下培养72 h，无菌落生长为最小杀菌浓度MBC。

1.3.4 中药银黄消痤对PA生物膜形成的影响:参照文献[6]，配制中药银黄消痤终浓度分别为1/4 MIC和1/2 MIC、1 MIC、2 MIC的含药BHI培养基。将96孔细胞培养板分为空白组、对照组和4个银黄消痤组进行实验，4个银黄消痤组加入50 μL痤疮丙酸杆菌菌悬液后用含相应浓度中药银黄消痤的BHI培养基150 μL培养，对照组加入50 μL痤疮丙酸杆菌菌悬液后用不含药的BHI培养基培养，空白组只加入50 μL BHI培养基，不加菌悬液。将96孔板置于37℃厌氧条件下培养72 h后，取出培养板，于酶标仪590 nm波长处读取吸光度值，计算生物被膜形成抑制率。生物被膜形成抑制率(%)=(吸光度值对照组-吸光度值样品测定孔)/吸光度值对照组×100%。实验重复3次。再取24孔板，置入预先泡酸处理的盖玻片，分为银黄消痤组和对照组、空白组，按上述方法处理各组后，将24孔板置于37℃厌氧条件下培养72 h，取出玻片，结晶紫染色[7]，显微镜下观察各组生物膜形态的变化。

1.3.5 中药银黄消痤抑制PA黏附的效果：取96孔细胞培养板，每孔各加入100 μL PA菌悬液，分为1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC和2 MIC 4个银黄消痤组和BHI对照组，4个银黄消痤组各加入相应浓度的含药BHI培养基100 μL，对照组加入BHI培养基100 μL，另设置无菌空白组加入BHI培养基200 μL。置于37℃厌氧条件下分别培养1 h、2 h、3 h、4 h后，弃去培养基，结晶紫染色，读取酶标仪590 nm波长处的吸光度值。每个浓度设置3个复孔，实验重复3次。

1.4 统计学分析 将所有数据录入Microsoft Office Excel 2016软件中进行整理，采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生长动力学检测 随着培养时间的延长，PA的菌液浓度均呈上升趋势，而在96孔板中的细菌生物被膜黏附量增长趋势不明显。见图1。

图1 PA菌液浓度及PA生物膜生长量曲线图

2.2 中药银黄消痤对PA的MIC及MBC 微量二倍稀释法结果显示，中药银黄消痤对PA的MIC为2.34 mg/mL，MBC为37.5 mg/mL。

2.3 中药银黄消痤对PA生物被膜形成的影响 干预72 h后，空白组未见细菌生长。1/2 MIC、1 MIC、2 MIC银黄消痤组的生物被膜形成抑制率均高于1/4 MIC银黄消痤组,且2 MIC银黄消痤组的生物被膜形成抑制率均高于1/2 MIC与1 MIC银黄消痤组(均P<0.05)，但1/2 MIC银黄消痤组与1 MIC比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。镜下可见对照组和1/4 MIC银黄消痤组菌体边界模糊且相互重叠，形成团块，形成了具有独立单位的典型生物被膜结构，但随着药物浓度的增加，菌体逐渐趋于分散状态，在2 MIC银黄消痤组中只有少量细菌粘连，大部分呈散在分布，见图2。

表1 5组PA生物被膜形成抑制率的比较(x±s)

图2 5组PA生物被膜形成情况(结晶紫染色，×1000)

2.4 中药银黄消痤对PA生物膜黏附作用的影响 干预2 h、3 h、4 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC银黄消痤组PA生物被膜黏附作用均低于对照组，且干预4 h后1/4 MIC银黄消痤组PA生物被膜黏附作用也低于对照组(P<0.05)，但中药银黄消痤对PA生物被膜黏附的抑制作用的浓度依赖性不明显。见表2。

表2 5组PA生物被膜黏附情况的比较(x±s，吸光度值)

3 讨 论

细菌生物被膜是由多糖基质、纤维蛋白和脂质蛋白等构成的骨架保护结构，可以对抗外界不利环境[8]。生物被膜不仅使细菌牢固附着于创面组织,还可以保护细菌免受抗生素、消毒剂和免疫系统的攻击,导致感染持续时间长、创面迁延不愈[9]。尽管目前痤疮的确切病因及发病机制尚不十分明确，但微生物被认为是其发病的重要病因之一[10]，而微生物在毛囊中大量繁殖并形成生物被膜结构是痤疮发病的关键机制。PA为痤疮患者毛囊皮脂腺内第一优势菌群，与痤疮的炎症损害及严重程度有着很大关系。

目前，临床上主要应用抗生素及维A酸类药物等治疗痤疮，但不良反应较多，且容易出现细菌耐药性。中药由“活性成分群”构成，按照一定要求配伍组合，通过多靶点、多途径发挥整合调节作用。有研究显示，中药主要是通过调节人体的免疫系统来对抗病原微生物[11]，在临床治疗中我们亦发现中药及中药复方具有比较强的抗感染作用。近年来，使用中药及其提取物治疗痤疮得到越来越多的关注，相关的机制研究日益增多[12-14]。中药银黄消痤是陕西中医药大学皮肤科院内制剂，其处方以《医宗金鉴·外科心法要诀》中枇杷清肺饮为基础加减化裁而成，全方由金银花、黄芩、枇杷叶、黄连、连翘、野菊花、薏苡仁、白花蛇舌草、丹参等10余味药物组成,其中金银花、黄连、黄芩等中药具有广谱抗菌、抗炎等作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及部分真菌等均有抑制作用，并能增加巨噬细胞的吞噬功能,减少炎性渗出[15]；白花蛇舌草能刺激体内网状内皮系统增生，并可增强白细胞的吞噬能力；丹参可活血化瘀，改善微循环[16]，减轻上皮角化，其有效成分丹参酮可抗炎、抑菌，并可对抗雄激素从而抑制皮脂分泌等。

本课题组前期临床研究显示，采用中药银黄消痤治疗痤疮患者，总有效率达到92%[3]，本研究结果显示，干预72 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC银黄消痤组的PA生物被膜形成抑制率均高于对照组和1/4 MIC银黄消痤组(P<0.05)，提示一定浓度的中药银黄消痤能够有效抑制PA生物被膜的形成。且干预2 h、3 h、4 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC银黄消痤组痤疮丙酸杆菌黏附作用均低于对照组，干预4 h后1/4 MIC银黄消痤组黏附作用也低于对照组(P<0.05)，提示中药银黄消痤浓度为1/2 MIC时，在干预早期即对PA的黏附作用具有抑制性，即使是使用1/4 MIC的低浓度中药银黄消痤，干预4 h后也可抑制PA的黏附作用。

综上所述，一定浓度的中药银黄消痤对临床分离PA的生长和黏附有较强的抑制作用，这可为临床用药治疗痤疮顽疾提供参考。