非水相酶促合成不同链长的对香豆酸酯及其自由基清除能力

尹霞，辛璇，李晓凤

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

对香豆酸(PCA)是一种广泛存在于水果和蔬菜中的植物酚酸，如苹果、葡萄、柑橘、菠菜和谷类，在一些中药中也有丰富的含量[1-4]。它具有丰富的生物活性，包括清除自由基、抑制脂质过氧化、保护机体免受氧化性心脏损伤[5]、抗炎活性[6]。然而，据报道，对香豆酸的亲水性是一个严重的缺点，因此限制了它们在脂肪和油脂系统[7]中的抗氧化作用。为了克服这一限制，报道了通过酯化向酚酸中添加脂肪族侧链基团，验证了酚酸的改性后抗氧化活性增强，从而产生有价值的具有潜在乳化作用的酚类脂类，提高抗氧化性能。

迄今为止，已有报道称酚酸的酰化大多是通过化学催化或生物催化实现的，但传统的化学催化存在选择性差、试剂毒性大、条件苛刻等明显缺点。众所周知，酶催化可以克服化学催化的缺点，具有环境友好、副作用少、选择性高等明显优势[8,9]。尽管对香豆酸的酯化化学合成反应有报道，但催化效率低，且合成产物的抗氧化活性几乎没有研究[10]。

酚酸的抗氧化能力在总体上已经得到了充分的证明，特别是在亲脂体系中，对香豆酸具有显著的抗氧化能力，可与BHA/BHT[11]相媲美。与此同时，许多报道表明，酚酸作为抗氧化剂的效果是通过酯化而增强的[12]。固定化脂肪酶是合成各种酚类酯的最常用酶之一。在这种背景下，通过酶催化不同链长对香豆酸，可以充分增加改性后化合物的稳定性和抗氧化活性，特别是油脂系统的抗氧化活性，然而，直接与不同的酚酸的酯化脂肪酸醇非常低效，通过与对香豆酸甲酯与醇进行酯交换可以达到更高的转化率[13]。

因此，通过固定化脂肪酶，以对香豆酸甲酯和不同的脂肪醇为原料合成了一系列对香豆酸酯衍生物，为对香豆酸的改性提供了一种简便有效的途径。考察了脂肪酶种类、溶剂、含水量、底物摩尔比、温度和反应时间对催化性能的影响。在最佳条件下，合成了不同链长PCA酯类衍生物。在清除自由基实验中表现出良好的抗氧化能力，有望在不同的食品、药物和化妆品体系中得到应用，也为酯类衍生物的合成提供了有益的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲基反式对香豆酸酯(纯度＞98%)和1-辛醇均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Novozym 435、Lipozyme 40086、Lipozyme TLIM、Lipase PSIM均购自丹麦诺维信公司；Lipase AY 30、Lipex Evity 100 t、AMANO Lipase PS均购自日本天野酶公司。

1.2 主要仪器

KH-2000型薄层色谱扫描仪，上海科贺生化科技有限公司；高效液相色谱-质量光谱仪（LC-MS），（Bruker Co.，德国）等。

1.3 试验方法

1.3.1 脂肪酶催化对香豆酸甲酯的酯交换反应

将甲基反式对香豆酸酯（20 mM）、脂肪醇（1000 mM）和固定化脂肪酶（40 mg/mL）分别置于吡啶/环己烷（4:6）（V/V）中，在活化分子筛（4Å，10%W/W）的存在下进行。随后，将反应混合物在50 ℃下180 r/min的搅拌器上孵育4 d。在规定的时间间隔从反应混合液中提取20 μL，用甲醇稀释50倍，高效液相色谱（HPLC）分析，每个反应重复三次。为获得高纯度的产品，反应液体与甲醇通过减压蒸馏纯化，然后分成不同的组件通过薄层色谱洗脱液己烷/EA（85:15，V/V）0.3 mm层硅胶通过紫外灯（254 nm）观察产物及其条带，如果需要，炭化后喷洒30%（V/V）硫酸加热（200 ℃）紧随其后。在真空干燥条件下，所有产品均为黄色粉末，通过高效液相色谱分析，其纯度超过95%。

1.3.2 高效液相色谱分析

反应混合物在4.6 mm A 250 mm Zorbax bs-c18柱（Agilent Technologies Co.，Massachusetts）上使用Waters 600E泵和Waters 2996 UV/光电二极管阵列检测器（Waters Corp.，Massachusetts）在308 nm处进行分析。流动相采用甲醇和水的混合物（85:15，V/V）流速为0.9 mL/min。对香豆酸1、反式对香豆酸甲酯2、丁基酯3a、己基酯3b、辛酯3c、癸酯3d、月桂酯3e的保留时间分别为2.65、3.33、5.06、7.46、12.30、22.12、42.08 min。转化率和初始速率分别由方程式1和方程式2计算，其中A0和At分别为反应前和反应后对-香豆酸甲酯的峰面积；C0和Ct分别为反应前后对-香豆酸甲酯的浓度（mmol/L）；t是反应时间（h）。

1.3.3 不同链长对香豆酸酯抗氧化能力测定

为了评价p-CA酯类衍生物[14]清除DPPH自由基的能力，对Blois方法进行了轻微修改。以乙醇为溶剂，制备浓度为2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液。溶液保存在4 ℃的冰箱中供以后使用。将0.5 mL p-CA酯衍生物加入4 mL 2×10-4mol/L DPPH自由基溶液中摇匀，室温静置30 min。然后测量517 nm处的吸收值Ai。同时测定4 mL 2×10-4mo1/L DPPH自由基溶解在0.5 mL 60%乙醇混合物中的吸光度A0。清除DPPH的百分率计算公式如下:

式中，A0为控制反应的吸光度，A1为p-CA或其他清除剂存在时的吸光度。

1.3.4 统计分析

所有检验均为3个平行，数据以均数±标准差表示。采用杜基多重比较检验来确定参数平均值之间的显著差异。使用SPSS 17.0软件（SPSS, Inc., Chicago,IL）分析数据。p＜0.05认为有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 反应产物分析

图3 脂肪酶Novozym435催化转化合成对香豆酸己酯液相色谱图Fig.3 HPLC diagram of catalytic conversion of Novozym435 to p-coumarate hexyl ester

图4 脂肪酶Novozym435催化转化合成对香豆酸辛酯液相色谱图Fig.4 Diagram of catalytic conversion of Novozym435 to octyl coumarate

图5 脂肪酶Novozym435催化转化合成对香豆酸癸酯液相色谱图Fig.5 HPLC diagram of catalytic conversion of Novozym435 to decyl p-coumarate

图6 脂肪酶Novozym435催化转化合成对香豆酸月桂酯液相色谱图Fig.6 HPLC diagram of catalytic conversion of Novozym435 tolauryl p-coumarate

将脂肪酶Novozym 435对对香豆酸甲酯催化转酯后的反应液进行高效液相色谱分析，其液相色谱图如图1～6所示。

图1 对香豆酸甲酯的标液液相色谱图Fig.1 Standard liquid chromatography of methyl coumarate

对照图1与图2～6可知，对香豆酸甲酯发生转酯反应之后的生成的对香豆酸丁酯、对香豆酸己酯、对香豆酸辛酯、对香豆酸癸酯、对香豆酸月桂酯的保留时间分别为5.08、7.46、12.30、22.12、42.08 min。

图2 脂肪酶Novozym435催化转化合成对香豆酸丁酯液相色谱图Fig.2 HPLC diagram of catalyzed conversion of Novozym435 to butyl p-coumarate

2.2 非水相体系催化转酯反应

2.2.1 脂肪酶对反应体系的影响

以脂肪酶PSIM、Lipozyme 40086、脂肪酶AY 30、Lipex Evity 100T、脂肪酶PS AMANO、Lipozyme TLIM、Novozyme 435等7种固定化脂肪酶对香豆酸甲酯酯交换反应进行筛选，结果见表1。在7种脂肪酶中，Novozym 435在有机溶剂中反应12 h后底物转化率（45.20%）和初反应速率[2.46 mmol/(L·h)]最好，而其他脂肪酶几乎不能催化反式对香豆酸甲酯的酯交换反应。因此，本研究选择Novozym 435作为合成对香豆酸酯衍生物的生物催化剂。

表1 脂肪酶对对香豆酸甲酯酯交换反应的影响Table 1 Effect of lipase on transesterification of methyl p-coumarate

2.2.2 有机溶剂对反应体系的影响

对于对香豆酸甲酯的酯交换反应，溶剂在反应体系中的作用非常重要，有机溶剂的组成对脂肪酶的活性和固体底物的溶解有很大的影响。虽然对香豆酸甲酯在大多数有机溶剂中都能溶解，但本实验表明，疏水体系反应中酯交换反应的转化率更高，尤其是环己烷（如图7）。

图7 有机溶剂对Novozym 435催化合成对香豆酸辛酯的影响Fig.7 Effect of organic solvents on octyl coumarate catalyzed by Novozym 435

可以认为，疏水溶剂的加入降低了反应体系的极性，从而通过阻止水剥离来减弱极性溶剂对脂肪酶的失活作用。这与“疏水溶剂有利于脂肪酶活性的维持”的理论是一致的。结果表明，由环己烷和吡啶组成的二元溶剂是最适合该反应的反应介质，提供了期望的酯衍生物，在24 h转化率为63.62%。此外，为了进一步提高转化率，还研究了吡啶与环己烷的配比对酯交换反应的影响。实验结果进一步证实了它在疏水体系中具有较高的转化率，当吡啶与环己烷的比例为1:9时，反应速率和转化率达到最大，转化率可达到98%（如图8）。

图8 不同溶剂配比对转化率的影响Fig.8 Influence of different solvent ratio on conversion rate

2.2.3 反应体系条件对转酯反应的影响

为了进一步优化反应条件，我们依次考察了一些关键变量对脂肪酶催化的香豆酸甲酯酯交换反应的影响，见图9～12。

图9 温度对转酯反应的影响Fig.9 Influence of temperature on transesterification reaction

图9 温度、图10酶的用量、图11底物摩尔比和图12分子筛用量对香豆酸酯交换反应的影响。除非另有说明，否则采用以下反应条件：20 mM反式对香豆酸甲酯、80 mM 1-辛醇、40 mg/mL Novozym 435、2 mL 90%环己烷-吡啶二元溶剂、50 ℃、180 r/min、反应时间24 h。

图10 酶的用量对转酯反应的影响Fig.10 Influence of enzyme dosage on transesterification reaction

图11 底物摩尔比对转酯反应的影响Fig.11 Effect of substrate molar ratio on transester reaction

图12 分子筛用量对转酯反应的影响Fig.12 Influence of molecular sieve dosage on transesterification reaction

图9 显示了20～70 ℃不同温度下反应温度对酯交换反应的影响。Novozym 435是一种耐热酶，温度范围很广（20～110 ℃）。较高的温度可能会增加其催化活性。转化率越高，引发速率越高，温度越高。较高的温度增加了底物和酶之间有效碰撞的频率。50 ℃的反应温度足以在48 h内使转化率高达99%。图10显示了脂肪酶用量对反式对香豆酸甲酯酯交换反应的影响。事实上，较高的脂肪酶含量为酰基酶中间体的形成提供了更多的活性位点，从而缩短了反应平衡时间。考虑到脂肪酶的成本和效率，40 mg/mL的Novozym 435在经济上更有吸引力，对反应没有不良影响。在优化的反应条件下，快速合成了对香豆酸辛酯，24 h内转化率达99%。图11显示的摩尔比的增加辛醇/对香豆酸甲酯从1到20（mol/mol）带来显著增加反应速率和转换，而进一步增加疏水性，辛醇过量导致反应效率的下降归因于它们之间的交互酰基供体/对香豆酸甲酯摩尔比率和其他因素影响的酰化反应。由于形成酯的量受反应平衡控制，因此要促进对香豆酸酯的合成，就需要稍过量的醇给体。因此，本研究选用的摩尔比为1:8。图12显示了分子筛用量的影响，由于水解反应是由甲酯和辛酯发生的，因此控制含水率尤为重要。加入4A分子筛可以看出，随着分子筛质量的提高，水解反应立即被抑制，反应和转化率显著提高。限制反应介质的含水量，使反应平衡朝着酯交换反应的方向发展，使水解作用降到最低。但在反应介质中有少量的水是必需的，以溶解酶并保持其活性;但如果含水量过高，则会降低反应的产率。

2.3 对香豆酸酯衍生物对自由基清除作用

在DPPH测定中，抗氧化剂能将稳定的自由基DPPH还原为黄色的二苯基-苦基肼。这种方法是基于乙醇中DPPH的减少，在存在供氢抗氧化剂的情况下，由于反应中形成了非自由基形式DPPH-h。DPPH常作为评价抗氧化剂清除自由基活性的试剂。20 uM时对香豆酸的DPPH自由基清除活性为56.34%。在相同浓度下，对香豆酸月桂酯、对香豆酸癸酯、对香豆酸辛酯、对香豆酸己酯、对香豆酸丁酯和TBHQ的DPPH自由基清除活性分别为73.91%、70.32%、68.90%、60.62%、43.65%和67.51%。结果表明，对香豆酸月桂酯清除DPPH自由基的活性高于对香豆酸和TBHQ，但低于Trolox（图13）。这些数据清楚地表明，对香豆酸是DPPH的有效电子或氢原子供体，长链醇的引入大大提高了其抗氧化能力。与同类的酚酸衍生物作对比[15]，非水相酶促合成的长链酯的自由基清除能力与同类型酚酸比较有显著提高，同时该研究表明酚类物质与抗氧化活性上存在相应的量效关系。将对香豆酸月桂酯与果肉中的总有机酸的抗氧化能力作对比[16]，发现其清除率73.91%明显高于总有机酸56.21%，证明其良好的清除自由基能力。

图13 对香豆酸衍生物和参比抗氧化剂对DPPH自由基的清除活性Fig.13 DPPH radical scavenging activity of coumaric acid derivatives and reference antioxidants

3 结论

本试验研究了Novozym 435脂肪酶在非水相体系中催化对香豆酸甲酯与几种脂肪醇的酯交换反应，结果显示：在非水相中转酯化反应后的产物转化率可达98%并得到该反应最佳条件为，脂肪酶Nov.435 40 mg/mL，溶剂为吡啶：环己烷=1:9，底物摩尔比=1:10，温度50 ℃，转速180 r/min。通过DPPH自由基清除能力的测定，合成的对香豆酸月桂酯、对香豆酸癸酯的清除率为73.91%、70.32%均高于原化合物56.34%，表明对香豆酸酯衍生物表现出较好的抗氧化活性。因此，合成的具有不同抗氧化活性的酯类衍生物有望应用于不同的食品、药物和化妆品体系中，为其衍生物在食品工业中的应用提供了有益的指导。