龟纹瓢虫生殖系统及卵子发生观察

刘志伟，钟国辉，王永跃，王兴民，毕可可

（1.广州市林业和园林科学研究院，广东 广州 501405；2.龙门县林业局，广东 龙门 516800；3.华南农业大学生物防治教育部工程研究中心，广东 广州 510642）

【研究意义】龟纹瓢虫（Propylea japonica）属鞘翅目瓢虫科瓢虫族龟纹瓢虫属，广泛分布于我国南北各地［1］，是蚜虫的重要天敌［2-4］，也捕食蚧壳虫、草地贪夜蛾、木虱［5-7］，具有耐高温、繁殖力强、对多种农药表现高耐受性等优点［8-10］，是农林业重要天敌昆虫，具有很大的开发应用前景。要实现龟纹瓢虫大规模生物防治，人工繁殖非常重要，而生殖系统和卵子发生相关研究将为人工繁殖提供理论依据。【前人研究进展】昆虫卵巢管有无滋式和具滋式两种类型［11］，其中具滋式又划分为端滋式和多滋式［12］。无滋式指卵巢管内无滋养细胞，滤泡细胞和血淋巴为卵细胞发育提供营养物质和RNA，少量营养物质由卵细胞自身合［13-14］。端滋式卵巢管中，滋养细胞集中在卵巢管前段的生殖区，通过营养索向卵母细胞输送营养物质［15］。多滋式卵巢管中，滤泡细胞分布在整个卵巢管，通过胞内连丝将营养物质和RNA 输入卵母细胞［14］。国内外对瓢虫生殖系统和卵子发生已有研究，Mpakou 等［16］阐述了二星瓢虫（Adalia bipunctata Linnaeus）卵子发生过程中细胞凋亡的3 种类型，分别为细胞程序死亡、细胞自噬和细胞质死亡；Maffei 等［17］发现Eriopis connexa为端滋式卵巢管；Osawa［18］研究了在食物匮乏情况下，异色瓢虫卵巢管重新吸收卵细胞；陈洁等［19］根据卵母细胞所在位置、体积、形态和细胞核的变化，滋养细胞和滤泡细胞的形态变化，以及卵黄沉积、分布情况将异色瓢虫（Harmonia axyridis Pallas）卵子发生划分为3 个时期7 个阶段；此外，小黑瓢虫（Delphastus catalinae）、七星瓢虫（Coccinella septempunctataL.）、孟氏隐唇瓢虫（Cryptolaemus montrouzieri）也有生殖系统观察研究［20-22］。【本研究切入点】有关龟纹瓢虫的研究由来已久，主要在生物防治［23］、耐药性［10,24］、人工饲料［25］等方面，但还未形成规模化的生物防治应用，大量繁殖是实现生物防治应用的基础，而研究相对匮乏的生殖系统对繁殖非常重要。【拟解决的关键问题】本研究在张天澍等［26］研究的基础上，结合查阅相关资料，应用组织解剖和石蜡切片技术，补充雌雄生殖系统摄像，以及更加清晰的卵子发生过程观察结果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

龟纹瓢虫采自广东省内，实验条件（光照12 h、黑暗12 h，温度26±1℃，湿度75%～80%）下用蚜虫饲养。

Ring’s 生理盐水：20%氯化钠，10%氯化钾，10%氯化钙，5%碳酸氢钠，1%磷酸二氢钠。

1.2 试验方法

1.2.1 生殖系统解剖 将刚羽化的成虫按雌雄比例1 ∶1 配对饲养，逐日解剖成虫。先用70%的酒精浸泡样品10 min，之后在滴有Ring’s 生理盐水的点滴盘中进行解剖，剔除生殖系统周围的组织，用生理盐水冲洗干净，最后将完整的生殖器置于体视镜（Zeiss，Stereo Discovery V2.0）下观察并拍照。

1.2.2 卵巢管石蜡切片 选取羽化5 d 左右的雌成虫，解剖出卵巢，方法同1.2.1，分离出完整的卵巢管，经Bouin’s 固定液固定、70%酒精冲洗、梯度浓度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、H.E 和甲苯胺蓝染色等系列过程，在光学显微镜观察并拍照。石蜡切片厚度为3～4 µm。

2 结果与分析

2.1 雌性生殖系统

龟纹瓢虫雌性内生殖系统位于第3～8 腹节，包括1 对卵巢、1 对侧输卵管、中输卵管、生殖腔。每侧卵巢由11～13 根卵巢管组成，所有卵巢管通过端部的端丝束缚在一起，端丝白色，形成悬带，悬附于第3 腹板。2 个侧输卵管汇合于中输卵管，中输卵管开口于生殖腔。受精囊暗红色，角质化，半月形，其周围很少附着组织，近乎裸露。雌虫羽化后的约前3 d，卵巢附着很多白色气管，之后气管逐渐减少，直至卵成熟，几乎不见气管。当临近产卵，侧输卵管变短变宽，侧输卵管管壁变得很薄，组织疏松（图1A）。

2.2 雄性生殖系统

龟纹瓢虫雄性内生殖系统位于第2～8 腹节，包括1 对精巢、1 对雄性附腺、1 对输精管、贮精囊、射精管。每侧精巢由10 个椭圆形的精巢管一端向内汇聚而成。输精管和附腺比较短。射精管较长，半透明状，与弯管相连（图1 B）。

图1 龟纹瓢虫生殖系统Fig.1 Reproductive system of Propylea japonica

2.3 龟纹瓢虫卵巢管结构

龟纹瓢虫卵巢管属于端滋式卵巢管，分为原卵区（germarium）、生长区（vitellatium）和端丝（terminal filament）。卵巢管外围包被1 层管壁膜，由2 层薄膜构成。当卵细胞成熟且落入侧输卵管后，管壁膜清晰可见。原卵区分布着卵母细胞和滋养细胞，卵母细胞比较分散。原卵区与卵黄区的衔接处称为卵巢管颈区，原卵区的卵细胞集中于此。卵黄区包含卵细胞，前滤泡细胞和滤泡细胞，卵细胞外层由滤泡细胞组成的细胞层覆盖，这种结构称为卵泡。龟纹瓢虫卵巢管卵黄区可见4 个卵细胞（图2A、B）。

2.4 龟纹瓢虫卵子发生

龟纹瓢虫的蛹期就已经形成了卵巢，并且已经完成生殖细胞的增殖与分化，形成由滋养细胞和卵母细胞组成的生殖细胞簇，但此时滋养细胞与卵母细胞形态相似，难以区分。

在卵细胞发生前期，滋养细胞和卵母细胞集中在原卵区且靠近端部，滋养细胞较集中，细胞核较大，染色深，几乎充满整个细胞。自然状态下，滋养细胞呈现白色，通过切片染色细胞间偶见间质细胞，并出现双核现象（图2B、C），细胞核活动增强，出现染色质配对分离，这可能是为卵细胞输送RNA 和其他营养物质的需要（图2B）。卵母细胞分散在原卵区下端，个体比滋养细胞小，细胞核明显可见（图2C）。

图2 龟纹瓢虫卵巢管原卵区纵切Fig.2 Longitudinal section of germarium of Propylea japonica ovariole

卵细胞发生中期，卵细胞逐渐向卵黄区移动，细胞核明显，染色较深，形成滤泡细胞和卵细胞组成的卵泡（follicle，图3B）。卵细胞继续增大，椭圆形，细胞质增多，细胞核出现胚泡，且胚泡染色明显比细胞质浅，细胞核处在胚泡中央（图3A）。

卵细胞发生的后期，卵细胞和胚泡继续增大，卵细胞为椭圆形，而其周围的滤泡细胞却为圆形，此时期滤泡细胞核染色较深（图3B）。

卵细胞发生的末期，卵细胞椭圆形，可见密集的卵黄颗粒和散布其中的脂滴。卵细胞周边附着圆形滤泡细胞，且逐渐与滤泡细胞层分离，出现间隙，间隙首先出现在卵细胞之间的衔接处和卵巢管柄上方，随之生成卵黄膜，并逐渐与卵巢管柄分离（图3C、D）。

图3 龟纹瓢虫卵巢管生长区纵切Fig.3 Longitudinal section of vitellarium of Propylea japonica ovariole

3 讨论

异色瓢虫每侧卵巢管数量25～33 根［19］，单雌平均产卵量1 835 粒［27］；七星瓢虫每侧卵巢管数量48 根，单雌产卵量400～900 粒，最多可达 2 000 多粒［21］；小黑瓢虫每侧卵巢管数量4 根［20］，单雌平均产卵量378.5 粒［28］。本研究观察到龟纹瓢虫每侧卵巢管数量11～13 根，单雌平均产卵量600 粒，最多可达1 100 粒［1］。推测瓢虫卵巢管数量与产卵量呈正相关。

试验观察到龟纹瓢虫的卵巢管端滋式，且滋养细胞分散，细胞核几乎充满整个细胞，细胞膜清晰，未发现细胞分裂，与藻食亚目的Hydroscapha natansLeConte［15］不同的是，卵巢管未见合胞体（syncytium）。Buning［29］将鞘翅目多食性亚目昆虫卵巢管分为3 个类型，分别为初级阶段：滋养细胞分散，细胞膜界面清晰，细胞核容易辨别，细胞间仅通过胞间连丝相连；过渡阶段：滋养细胞积聚形成细胞簇，细胞核非线性排列；次级阶段：原卵区出现合胞体。据此推测龟纹瓢虫卵巢管属于原始类型。

研究发现，滤泡细胞是黑腹果蝇卵黄原蛋白主要合成位点［30］，也能协调卵黄原蛋白从血淋巴输入细胞内［31］，其细胞间的桥粒（desmosomes）和微管塑造及维持卵的形态［32］。在对Tenebrio molitorL.研究发现，部分蛋白可通过滤泡细胞间隙进入卵细胞［33］。龟纹瓢虫滤泡细胞的形态和数量在卵细胞发育过程中变化较大，卵子发生前期和中期，滤泡细胞呈椭圆形并且排列紧密，此时由滋养细胞和滤泡细胞共同为卵细胞提供营养物质；卵子发生后、末期，随着卵细胞增大及卵黄的积累，滤泡细胞呈圆形且体积增大，细胞间隙较大，细胞核染色很浅，靠近滤泡细胞层处，卵黄颗粒较小，向内卵黄颗粒增大，推测滤泡细胞之间的间隙为卵细胞物质运输的通道。

通过对果蝇和蝎蛉卵巢管研究发现，滤泡细胞参与卵壳的形成［34-35］。在Rhyncophorus palmarumLinnaeus 中也发现，当卵细胞成熟后，滤泡细胞层消失［36］。Loof［37］研究了马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineataSay）的滤泡细胞参与卵黄膜和卵壳形成的过程。卵黄沉积完成时，卵细胞与卵巢管柄逐渐分离，滤泡细胞与卵细胞出现间隙，靠近卵巢管柄处，滤泡细胞减少直至消失，可能与卵壳形成有关。

4 结论

龟纹瓢虫单侧卵巢管维持在11～13 根之间，每根卵巢管存在多个不同发育阶段的卵细胞，且每次只能成熟并产出1 粒卵，这有助于解释龟纹瓢虫多次产卵的现象，也一定程度决定了单雌一生产卵数量。卵细胞发育过程中，养分供给来自多次形态变化的滤泡细胞。综上所述，在开发人工饲料、开展龟纹瓢虫大量繁育工作中，应合理配置饲料成分，确保卵巢养分需求，促进卵细胞发育成熟。