棘孢曲霉液体发酵产β-葡萄糖苷酶培养基的优化

张玉千 周学 夏文静 郑丹 许晓风

摘要：以棘孢曲霉为生产菌株进行液态发酵生产β-葡萄糖苷酶，优化产酶培养基成分。采用单因素法对发酵培养基的碳源、氮源、碳氮比、磷酸盐的含量及吐温-80的浓度进行初步探索，借助正交设计试验法确定棘孢曲霉液态发酵产β-葡萄糖苷酶最优培养基组成。结合单因素试验和正交试验得到最优的培养基成分为2%蔗糖、0.16%尿素、碳氮比为30 ∶1、0.2% KH2PO4、0.125%吐温-80。利用优化后的培养基成分进行发酵产酶，β-葡萄糖苷酶的酶活力达到29.23 U/mL，是初始产酶培养基产酶活力的8.21倍。通过对培养基成分的优化，大幅度提高了β-葡萄糖苷酶的产量，为β-葡萄糖苷酶的生产提供了新的菌株，为提高槐角异黄酮的转化研究提供了新的途径及数据参考。

关键词：棘孢曲霉;β-葡萄糖苷酶;培养基优化;正交试验;单因素试验

中图分类号： S182  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）11-0208-05

收稿日期：2020-09-23

基金项目：江苏省大学生创新创业训练计划一般项目（编号：201913843026Y）;南京师范大学高等教育改革研究课题（编号：2018JG07042、2019JG09001）。

作者简介：张玉千（1985—），男，山东济宁人，硕士研究生，讲师，主要从事天然产物的分离纯化及微生物转化研究。E-mail：zqwl2000@163.com。

通信作者：许晓风，博士，教授，博士生导师，主要从事植物保护、分子遗传与分子生态方面的研究。E-mail：xuxiaofeng@njnu.edu.cn。

棘孢曲霉是曲霉属真菌，具有球形或椭圆形的顶囊，分生孢子为淡褐色球状，表面有刺突[1]。棘孢曲霉在自然界中分布广泛，常见于粮食、植物和土壤中。棘孢曲霉具有丰富的酶系，可分泌淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等产物，是一种重要的工业发酵微生物，被广泛应用于生产工业酶制剂、产品发酵等方面[2-3]。

目前，关于棘孢曲霉的研究主要集中在产酶条件的优化，尤其是产果胶酶和柚苷酶的研究。何海燕等从蚕沙堆积地土壤中筛选出产果胶酶的优良菌株，经过微波诱变得到稳定菌株，所产酶活性可达10.17 U/mL[4]。王耸等以柚皮为原料优化棘孢曲霉产柚苷酶的固体发酵条件，产酶量提高了7.38倍[5]。据报道，棘孢曲霉所产的β-葡萄糖苷酶活性较强，在微生物转化中尤其是对苷类物质糖苷键的水解反应中效果较好。Treebupachatsakul等发现棘孢曲霉产β-葡萄糖苷酶可以将糖转化为乙醇，为工业生物乙醇的生产提供较好的途径[6]。马迎迎等发现，棘孢曲霉可以将甜菊糖苷转化为甜菊醇，为甜菊醇的制备提供一种新的方法[7]。试验组在槐角黄酮苷的转化过程中发现，棘孢曲霉可以将染料木苷、槐角苷转化为5，7，8，4′-四羟基异黄酮[8-9]，后者是一种高效的酪氨酸酶抑制剂[10-11]，在医药、美容、食品等领域具有广阔的应用前景[12]。在棘孢曲霉转化槐角黄酮苷的过程中，β-葡萄糖苷酶是关键酶，提高该酶的产量可以增加产物得率。本试验在国内外相关研究的基础上进行液态发酵研究，通过优化培养基成分提高β-葡萄糖苷酶的产量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

试验菌种为棘孢曲霉，笔者所在实验室筛选鉴定，菌种保藏号为CCTCC NO：M2011264。

斜面培养基（20%土豆、2%葡萄糖、2%琼脂、pH值自然）、种子培养基[1% （NH4）2SO4、0.5% KH2PO4、0.1% MgSO4、6%葡萄糖]、发酵基础培养基[2%蔗糖、0.16% （NH4）2SO4、0.2% KH2PO4、0.02% MgSO4、0.001% FeSO4·7H2O、0.05%吐温-80、 pH值自然]。

水杨苷（湖北帝柏化工有限公司）、无水乙醇，苯酚亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、冰醋酸、无水乙酸钠均为分析纯，购自国药集团上海有限公司。

1.1.2 仪器与设备

试验主要仪器有ZHJH-C1214B超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）、MLS-3780高压蒸汽灭菌器[致微（厦门）仪器有限公司]、FA2204电子分析天平（上海方瑞仪器有限公司）、HZQ-X100恒温振荡培养箱（太仓市实验设備厂）、WFZ UV-2000紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及发酵培养

将4 ℃保藏的菌种转接至斜面培养基上，28 ℃培养2～3 d，用无菌水冲洗斜面孢子，做成1×108 CFU/mL的孢子悬液，充分振荡30 min。按10%接种量接入到100 mL液体发酵培养基中，30 ℃ 150 r/min摇床培养72 h。

取发酵液8 000 r/min离心10 min，取上清加无水乙醇，使乙醇浓度为70%～75%，放于4 ℃冰箱中沉淀过夜。10 000 r/min离心15 min，沉淀用0.2 mol/L pH值为4.6的乙酸-乙酸钠的缓冲液重新溶解，即得酶液，测定酶活力。

1.2.2 单因素试验

1.2.1.1 碳源的优化

发酵基础培养基中去掉碳源，分别加入2%的葡萄糖、蔗糖、麸皮、稻糠、玉米粉、麸皮+稻糠（1 ∶1）、麸皮+玉米粉（1 ∶1）作为唯一碳源，其他成分保持不变，配制液体培养基各100 mL，装入250 mL锥形瓶中，灭菌，按10%接种量加孢子悬液，30 ℃，150 r/min摇床培养72 h，按“1.2.1”节方法提取酶液，测酶活力。

1.2.1.2 氮源的优化

发酵基础培养基中去掉氮源，分别以0.16%的硫酸铵（无机氮源）、酵母浸膏、豆粕粉、蛋白胨、尿素为氮源，其他成分保持不变，配制液体培养基各100 mL，装入250 mL锥形瓶中，灭菌，按10%接种量加孢子悬液，30 ℃，150 r/min摇床培养72 h，按“1.2.1”节方法提取酶液，测酶活力。

1.2.1.3 碳氮比的优化

以蔗糖为碳源，硫酸铵为氮源，控制碳氮比分别为5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1，其他成分和发酵基础培养基一致，配制液体培养基各100 mL，装入250 mL锥形瓶中，灭菌，按10%接种量加孢子悬液，30 ℃，150 r/min摇床培养72 h，按“1.2.1”节方法提取酶液，测酶活力。

1.2.1.4 磷酸盐对产酶的影响

去除发酵基础培养基中的磷酸盐，分别加入KH2PO4，使质量分数为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他成分保持不变，配制液体培养基各100 mL，装入250 mL锥形瓶中，灭菌，按10%接种量加孢子悬液，30 ℃，150 r/min 摇床培养72 h，按“1.2.1”节方法提取酶液，测酶活力。

1.2.1.5 吐温-80对产酶的影响

去除发酵基础培养基中的吐温-80，分别加入吐温-80，使质量分数分别为0.050%、0.075%、0.100%、0.125%、0.150%，其他成分保持不变，配制液体培养基各100 mL，装入250 mL锥形瓶中，灭菌，按10%接种量加孢子悬液，30 ℃，150 r/min摇床培养72 h，按“1.2.1”节方法提取酶液，测酶活力。

1.2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，固定接种量为10%，装液量为100 mL，选择碳源、氮源、磷酸盐用量、吐温-80质量分数4个因素，按照表1所示的因素水平设计4因素3水平正交试验组合，按照“1.2.1”节的方法进行发酵，测酶活力。

1.2.4 酶活力测定方法

根据文献[13]的方法，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定β-葡萄糖苷酶酶活：取0.2 mL水杨苷加0.2 mL酶液，在60 ℃ 的水浴锅里加热10 min，取出，向反应液里加入1 mL DNS试剂，放入沸水中加熱5 min，冷却，定容至10 mL，540 nm下测定吸光度，根据葡萄糖标准曲线计算。

酶单位定义（U/mL）：在60 ℃、pH值=4.6的条件下，每1 mL酶液1 min水解底物产生1 μmol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。

葡萄糖苷酶活力单位（U/mL）=1 000×N×（D540 nm+0.012 8）/（180×0.816 9×0.2），N表示稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 碳源对产酶的影响

碳源为微生物新陈代谢提供所需的能源和合成产物的碳骨架，是微生物正常生长分裂的物质基础。碳源过多，在发酵过程中容易形成较低的pH值;碳源不足，容易使菌体过快衰老和自溶，不同的微生物所需要的碳源种类不同，需要通过试验进行优化。试验选用葡萄糖、蔗糖、麸皮、玉米粉、稻糠、麸皮+玉米粉（1 ∶1）、麸皮+稻糠（1 ∶1）等农副产品为碳源进行研究。由图1可知，蔗糖作为碳源时，最有利于产酶，酶活力最高为12.09 U/mL，其次是葡萄糖和玉米粉。蔗糖作为碳源时，分解率等于利用率，没有葡萄糖的积累，可以避免葡萄糖对β-葡萄糖苷酶的抑制作用。葡萄糖的效果仅次于蔗糖，可能是该菌体已经部分解除了葡萄糖的抑制。以麸皮、稻糠及其组合为碳源的β-葡萄糖苷酶酶活力较低，说明在液态发酵培养中，可溶性碳源容易被菌体吸收利用，见效较快。

2.2 氮源对产酶的影响

氮源对微生物的生长发育有着重要意义，微生物利用它在细胞内合成氨基酸和碱基，进而合成蛋白质、核酸等细胞成分[14]。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，体系pH值偏高，不利于代谢产物的积累;氮源不足，则菌体繁殖量少，生物量少，产物的生产量减少。分别以尿素、硫酸铵（无机氮源）、蛋白胨、酵母浸膏、豆粕粉为氮源进行发酵产酶。由图2可知，在以硫酸铵为氮源时，测得的酶活力最高，为12.88 U/mL，因此优选硫酸铵为氮源。

2.3 碳氮比对产酶的影响

碳氮比不当会影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成。碳氮比过高和过低均不利于细胞生长和外源蛋白表达与积累，过低导致菌体提早自溶;过高导致细菌代谢不平衡，最终不利于产物的积累。一般碳源因为既作碳架又作能源，因此用量要比氮多。由图3可知，碳氮比为30 ∶1 时酶活力最高，为11.55 U/mL，因此优选碳氮比为30 ∶1。

2.4 磷酸盐对产酶的影响

钾和磷都是微生物生长所必需的营养素，培养基中的KH2PO4既能提供氮磷元素又可以缓冲发酵液的pH值，保持微生物生长所需的酸碱度。本试验将KH2PO4浓度分别设为0.1% 、0.2% 、0.3% 、0.4% 、0.5%，结果如图4所示，0.2%和0.3%这2个浓度对应的酶活力较高，当磷酸盐浓度为0.2%时，测得最大酶活力为12.55 U/mL。因此KH2PO4的浓度选择0.2%。

2.5 吐温-80对产酶的影响

吐温-80为非离子型表面活性剂，可以增强细胞膜的通透性，能促进胞外酶的分泌，但浓度太大也会影响培养基中的溶氧，进而影响菌体生长和产酶。试验考查了不同吐温-80浓度对产酶的影响，由图5可知，控制的碳氮源分别是蔗糖和硫酸铵，当吐温-80质量分数为0.100%时，测得的酶活最大，为11.49 U/mL。

2.6 正交试验设计

通过表2对比4种因素对棘孢曲霉产酶的影响，结果表明RA>RC>RB>RD，碳源种类对棘孢曲霉产酶的影响最大，其次是磷酸盐浓度、氮源，影响最小的是吐温-80的浓度。通过比较k值，得到最优水平为A2B1C2D3，即2%蔗糖、0.16%尿素、0.2%KH2PO4、0.125%吐溫-80。

2.7 重复验证试验

为确定正交试验结果的优劣及稳定性，利用最优培养基组分进行3批重复验证试验，结果表明，平均酶活力为29.23 U/mL，均高于正交试验表中的9个试验中的酶活力，相当于初始培养基酶活力（3.56 U/mL）的8.21倍。因此，确定A2B1C2D3为最优组合且具有一定的稳定性。

3 结论与讨论

以前期筛选的棘孢曲霉为出发菌株，通过单因素试验和正交试验优化棘孢曲霉液态发酵培养基组分。结果表明，碳源、氮源对产酶的影响最大，优化得到的液态培养基的组分为2%蔗糖、0.16%尿素、0.2%KH2PO4、0.125%吐温-80。在此基础上进行发酵产酶，β-葡萄糖苷酶活力为29.23 U/mL，是基础初始培养基的酶活的8.21倍。

β-葡萄糖苷酶广泛存在于植物、动物、微生物中，其中来源于微生物的酶活性较高，研究报道较多。β-葡萄糖苷酶可水解β-D-糖苷键，解除纤维二糖对纤维素酶的抑制，在纤维素水解的过程中是关键的一步[15-17]，目前在生物能源、食品工程、过程转化等领域被广泛应用[18]。在产纤维素酶的菌株中，β-葡萄糖苷酶含量普遍较低。但黑曲霉除外，目前工业中也主要利用黑曲霉生产β-葡萄糖苷酶，通过培养基、培养条件的优化及诱变育种等方法提高β-葡萄糖苷酶的产量[15]。棘孢曲霉可分泌淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、柚苷酶、鼠李糖苷酶等多种酶[2，4，19-20]，其中柚苷酶的研究较多，β-葡萄糖苷酶的研究较少。棘孢曲霉经过优化后β-葡萄糖苷酶的酶活力有了明显提高，从而为β-葡萄糖苷酶的生产提供了新的菌株。

槐角是一种常用的中药材，富含黄酮异黄酮类化合物[21]，利用微生物的甲基化、羟基化、甲氧基化、水解等反应可以提高活性成分的含量、获得高附加值的代谢产物[22]。Wu等利用Schizophyllum commune转化槐角苷得到羟基化、甲基化等多种有价值代谢产物[23]。槐角中的染料木苷含量较高，但生物活性没有苷元染料木素的活性高。Chang等以槐角粉末为原料利用黑曲霉和酵母联合发酵培养，使染料木素的含量增加了34.45倍[20，24]。刘姜华利用米根霉LJH3将槐角苷转化成染料木素，转化率达80.2%[25]。在棘孢曲霉转化槐角的过程中，β-葡萄糖苷酶水解染料木苷分子中的糖苷键生成染料木素和葡萄糖，染料木素又被细胞色素P450酶羟基化形成5，7，8，4′-四羟基异黄酮[8，26]。通过优化棘孢曲霉产酶培养基提高酶活力，可提高染料木苷的转化效率，最终提高5，7，8，4′-四羟基异黄酮的收率。

参考文献：

[1]王 迪，倪 辉，李利君，等. 一株棘孢曲霉的鉴定及其柚苷酶合成规律[J]. 微生物学报，2013，53（7）：691-701.

[2]刘艳苓. 棘孢曲霉发酵柚皮产多酶组分分析及产柚苷酶工艺优化[D]. 厦门：集美大学，2015：1-2.

[3]王亚林，严建芳，吴灵英，等. 稻草发酵菌种的筛选与组配研究[J]. 饲料研究，2001（10）：24-25.

[4]何海燕，覃拥灵，陆世则，等. 产果胶酶棘孢曲霉的筛选鉴定及微波诱变育种[J]. 中国饲料，2015，2（2）：20-22.

[5]王 耸，刘艳苓，姜泽东，等. 棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶的条件优化[J]. 微生物学通报，2015，42（10）：1936-1944.

[6]Treebupachatsakul T，Nakazawa H，Shinbo H，et al. Heterologously expressed Aspergillus aculeatus β-glucosidase in Saccharomyces cerevisiae is a cost-effective alternative to commercial supplementation of β-glucosidase in industrial ethanol production using Trichoderma reesei cellulases[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2016，121（1）：27-35.

[7]马迎迎，陈育如，张伟娜，等. 棘孢曲霉转化甜菊糖为甜菊醇及纯化莱鲍迪苷A[J]. 微生物学报，2014，54（1）：62-68.

[8]陈育如，张玉千，玄 燕，等. 一株棘孢曲霉菌株及用该菌株制备5，7，8，4′-四羟基异黄酮的方法：ZL2011102258550[P]. 2011-12-14.

[9]Zhang Y Q，Zhao Y C，Lu Y Y，et al. Bioconversion of fructus sophorae into 5，7，8，4′-tetrahydroxyis oflavone with Aspergillus aculeatus[J]. PLoS One，2019，14（3）：e0211613.

[10]Chang T S，Ding H Y，Tai S K，et al. Mushroom tyrosinase inhibitory effects of isoflavones isolated from soygerm koji fermented with Aspergillus oryzae BCRC 32288[J]. Food Chemistry，105（4）：1430-1438.

[11]Chang T S. Two potent suicide substrates of mushroom tyrosinase：7，8，4′-trihydroxyisoflavone and 5，7，8，4′-tetrahydroxyisoflavone[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（5）：2010-2015.

[12]閆 军，陈声利，李春阳. 酪氨酸酶抑制剂及对黑素生物合成的影响[J]. 国外医学：皮肤性病学分册，2003，29（4）：250-253.

[13]刘 虎，陈育如，姜中玉. 固定化β-葡萄糖苷酶转化甜菊糖的研究[J]. 食品工业科技，2011，32（4）：170-172，176.

[14]李 涛，张朝辉，郭雅雯，等. 国内外微生物肥料研究进展及展望[J]. 江苏农业科学，2019，47（10）：37-41.

[15]石彩蕊. 黑曲霉诱变育种产β-葡萄糖苷酶研究[D]. 长沙：中南林业科技大学，2011：11-12.

[16]常治帅，兰 辉，包亚莉，等. 微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展[J]. 微生物前沿，2018，7（2）：79-86.

[17]倪嘉璐，张琪琳，沈利峰，等. β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及发酵培养基优化[J]. 浙江树人大学学报，2010，10（1）：22-26.

[18]Singh G，Verma A K，Kumar V. Catalytic properties，functional attributes and industrial applications of β-glucosidases[J]. 3 Biotech，2016，6（1）：3.

[19]刘艳苓，肖安风，李利君，等. 棘孢曲霉固态发酵α-L-鼠李糖苷酶调控机制及培养基优化[J]. 中国食品学报，2015，15（7）：10-17.

[20]陈 红，倪 辉，李利君，等. 棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶及其在柑橘果汁脱苦中的应用[J]. 菌物学报，2013，32（6）：1034-1045.

[21]Chang L，Ren Y，Cao L，et al. Simultaneous determination and pharmacokinetic study of six flavonoids from Fructus sophorae extract in rat plasma by LC-MS/MS[J]. Journal of Chromatography. B，Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2012，904（1）：59-64.

[22]Das S，Rosazza J P. Microbial and enzymatic transformations of flavonoids[J]. Journal of Natural Products，2006，69（3）：499-508.

[23]Wu J G，Yang X L，Ge J，et al. Biotransformation of sophoricoside in Fructus sophorae by the fungus Schizophyllum commune[J]. Bioresource Technology，2012，111：496-499.

[24]Feng C，Jin S，Xia X X，et al. Effective bioconversion of sophoricoside to genistein from Fructus sophorae using immobilized Aspergillus niger and Yeast[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2015，31（1）：187-197.

[25]刘姜华. 微生物转化槐角苷制备染料木素的研究[D]. 杭州：浙江工业大学，2017.

[26]Androutsopoulos V P，Ruparelia K，Arroo R R，et al. CYP1-mediated antiproliferative activity of dietary flavonoids in MDA-MB-468 breast cancer cells[J]. Toxicology，2009，264（3）：162-170.