鳜不同亚型瘦素受体基因克隆与表达分析

魏君冉，梁旭方，徐晶，蔡文静

华中农业大学水产学院/华中农业大学鳜鱼研究中心/农业农村部淡水生物繁育重点实验室/湖北省名优鱼育种与健康养殖工程技术研究中心，武汉 430070

瘦素(leptin)在1994年首次在小鼠(Musmusculus)中被发现，并描述为一种由肥胖基因(obese gene，ob)编码的、由脂肪细胞分泌的多肽激素[1]。在哺乳动物中，leptin由脂肪组织合成并分泌进入血液，通过血脑屏障后到达下丘脑并与瘦素受体(leptin receptor,lepR)结合，导致食欲降低和脂质代谢增加[2]。继leptin被发现后，Tartaglia等[3]随即在小鼠中克隆出lepR基因。已有的研究表明，哺乳动物只有一个lepR基因的旁系同源物，lepRmRNA通过3′端的可变剪切形成6种不同的亚型，这6种不同的亚型可分为长型(lepRb)、短型(LepRa、LepRc、LepRd、LepRf)、分泌型(lepRe)3类[4]。自首次发现小鼠的lepR基因十多年后[3]，Wong等[5]首次在海洋青鳉(Oryziasmelastigma)中发现鱼类的lepr基因。不同于哺乳动物的是，在大多数鱼类中只克隆出长型lepr，如日本青鳉(Oryziaslatipes)[6]、斑马鱼(Daniorerio)[7]和斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)[8]等。在少数鱼类中通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA,RACE)克隆出多个由leprmRNA 3′端可变剪切产生的受体亚型，如虹鳟 (Oncorhynchusmykiss)[9]，黑鲫(Carassiuscarassius)[10]和欧洲鲈 (Dicentrarchuslabrax)[11]。

鱼类长型受体具备哺乳动物lepR高度保守的结构，短型受体亚型的胞内结构、氨基酸组成及序列长度均存在差异，分泌型受体通常缺乏胞内区和跨膜区。与哺乳动物一致，鱼类的lepr只有长型受体亚型具备完全的重要功能域。在虹鳟[9]、大西洋鲑(Salmosalar)[12]及黑鲫[10]中的研究发现短型受体亚型可能与能量稳态有关。对于鱼类可溶性leptin受体的研究发现其与leptin-a的结合能力高于leptin-b，随着对多种鱼类的lepr基因的鉴定和研究的深入，发现lepr及其leptin结合域(leptin binding domain，LBD)在鱼类进化过程中相对保守[7-8,11,13]。

在哺乳动物及鱼类中，leptin通过其专一性受体结合传导抑食欲信号[14-15]。使用哺乳动物同源重组的leptin蛋白处理金鱼可导致其摄食量下降[16]，与在哺乳动物中观察到的结果一致，但类似的处理并不能影响银大马哈鱼(Oncorhynchuskisutch)[17]、鲶(Silurusasotus)[18]和绿海鲂(Lepomiscyanellus)[19]的摄食行为。这些不同的结果可能是鱼类和哺乳动物的leptin及lepr氨基酸序列差异较大引起的。因此，研究鱼类leptin及lepr的结构和功能对于研究鱼类摄食行为来说至关重要。鳜是我国特有的名贵淡水鱼，其食性奇特，自开口起终身以活饵为食，但经长期驯化才可食人工饲料。本课题组在前期研究氨基酸、脑肠肽(PYY)对鳜摄食调控等[20-21]工作的基础上，利用3′ RACE 技术，克隆鳜由mRNA的3′端可变剪切4个不同的lepr受体亚型，检测长型受体亚型在鳜组织中的表达情况，以及注射鳜同源重组leptin蛋白对其在脑中表达的影响，以期为后续深入研究鳜不同亚型的lepr在摄食调控、生理代谢中的功能及leptin-a和leptin-b的基因功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼及饲养条件

试验鱼来自华中农业大学鳜鱼研究中心，于农业农村部鳜鱼育种创新基地的循环水养殖系统中暂养14 d，水温为(25±1) ℃，pH为7.53～7.70，氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮质量浓度均低于0.1 mg/L，每天09：00和17：00各饱食投喂鲜活麦鲮(Cirrhinusmrigala)1次。

1.2 鳜leptin A和leptin B同源重组蛋白的表达、纯化及腹腔注射

鳜leptin A和leptin B同源重组蛋白的表达和纯化方法参照Yuan等[22]的方法进行。暂养结束后，随机选取9尾健康、体表无伤、质量为(230±16) g的鳜，饥饿24 h后，使用MS-222麻醉后称取质量。采用腹腔注射的方法，试验组注射1 000 ng/g的溶解于DPBS的leptin A或leptin B同源重组蛋白，对照组注射等量的DPBS溶液，每组注射12尾试验鱼。

1.3 组织的获取及RNA的提取

取样前，手术刀、手术剪及1.5 mL离心管均于37 ℃下质量分数为0.1%的焦碳酸乙二酯(DEPC)浸泡12 h，随后使用高压灭菌锅于120 ℃下处理30 min以去除DEPC，烘干后密封保存备用。鳜经MS-222麻醉后，解剖提取3尾试验鱼的垂体组织，所获得的垂体组织置于1.5 mL离心管并立即冻存于液氮中，取样结束后冻存于-80 ℃，用于后续lepr的3′- RACE克隆。取6尾试验鱼的端脑、中脑、小脑、垂体、下丘脑、延脑、肝脏、肠、肾、脂肪组织、鳃、脾和心组织置于1.5 mL离心管并立即冻存于液氮中，用于后续检测lepr基因的组织表达。分别在注射鳜leptins同源重组蛋白2 h及4 h后取每组鳜的脑组织，置于1.5 mL离心管并立即冻存于液氮中。

将用于lepr的3′- RACE克隆的垂体组织混合，其余组织取适量放入干净的1.5 mL离心管中，向装有组织的离心管中加入1 mL TRIzol 试剂，并装载入-20 ℃预冷的组织破碎仪夹板中，充分匀浆后按照有机溶剂抽提RNA法提取组织RNA。RNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测完整性后用于后续试验。

1.4 3′ RACE 引物设计及lepr cDNA全长克隆

从鳜基因组数据库中调取lepr基因序列，根据TaKaRa公司的3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase试剂盒的说明和lepr基因的核心序列设计外引物Lepr- Outer，以及内引物Lepr-Inner，用于扩增lepr的cDNA全长序列。用于3′RACE克隆的引物如表1所示。

表1 本研究中所使用的克隆及定量引物 Table 1 Primers used for clone and qRT-PCR in this study

使用TaKaRa公司的3′-Full RACE Core Setver2.0以及DNA聚合酶(TaKaRa，日本)合成鳜lepr基因cDNA全长序列。根据试剂盒的使用说明操作，获得PCR产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测无误后用于连接、转化。

1.5 lepr基因3′RACE克隆产物的连接、转化及测序

PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶并使用Omega公司的EZNA Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化回收，并连接入T克隆载体(北京全式金公司，pEASY©-T1 Cloning Kit)。将克隆载体转入DH5α感受态细胞(北京全式金公司)，用不含有氨苄的LB培养液在37 ℃的摇床中培育1 h后，吸取200 μL菌液涂于含有氨苄的LB固体培养基平板上，37 ℃过夜培养。挑选阳性克隆送武汉生工生物工程有限公司测序。

1.6 不同亚型的lepr基因的生物信息学分析

使用NCBI网站的BLAST及ORF finder工具将测序结果与鳜基因组调取的lepr序列进行比对，并预测其氨基酸序列。分别使用在线软件Signal P 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/)，TMpred Server (https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)及SMART:Main page (http://smart.embl-heidelberg.de/)预测测序所得的lepr序列的信号肽、跨膜区和结构域。从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)获取以下15个物种的lepr氨基酸序列：人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、爪蟾(Xenopustropicalis)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)、尖吻鲈(Latescalcarifer)、欧洲鲈、罗非鱼(Dreochromisniloticus)、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、虹鳟、大西洋鲑、日本青鳉、斑马鱼、黑鲫，利用Bioedit软件对上述氨基酸序列进行多重比对，并使用MEGA 6.0软件构建上述物种lepr蛋白质的系统进化树(bootstrap=1 000)。

1.7 qRT-PCR

通过qRT-PCR技术检测DNA的表达水平。20 μL反应体系：ChamQ SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，南京)10 μL，F/R引物0.4 μL，模板cDNA 1 μL，双蒸水8.2 μL。qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性15 s，引物特异性退火温度下30 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。溶解曲线以0.5 ℃/s的速度从95 ℃降低至65 ℃，每6 s采集1次信号。

2 结果与分析

2.1 lepr cDNA 3′RACE克隆

使用3′ RACE技术克隆获得leprcDNA，发现4个不同大小的DNA片段。经测序发现这4个DNA片段均为leprmRNA经3′可变剪切产生的不同亚型，长度分别为3 474、1 512、945和915 bp。

2.2 lepr基因与氨基酸序列分析

将使用3′RACE技术克隆得到的4条序列与从鳜基因组中获取的lepr序列进行比对分析，发现1个长型受体亚型lepr-L，3个由mRNA 3′端可变剪切产生的短型受体亚型：lepr-S1、lepr-S2、lepr-S3(图1)。lepr-L的CDS长度为3 474 bp，编码1 157个氨基酸；短型受体亚型lepr-S1、lepr-S2和lepr-S3的CDS长度分别为1 512、945和915 bp，分别编码503、314和304个氨基酸。序列分析发现，鳜lepr-L蛋白具有1个信号肽结构、1个跨膜区、1个免疫球蛋白(Ig) C2-like结构域、1个LBD结构域，2个FNIII结构域和2个重复的色氨酸/丝氨酸基序(WSXWS)，含有JAK和STAT功能域等全部胞内结构。除lepr-S1蛋白具备不完整的LBD结构域外，其余2个短型受体亚型均不具备LBD结构域，同时，所有短型受体亚型均丢失跨膜区和所有胞内结构域(图2)。如表2所示，鳜lepr-L的氨基酸序列与鱼类同源性高(42%～86%)，与哺乳动物同源性低(26%～28%)。

下划线部分氨基酸序列为lepr保守结构。The amino acid sequence of lepr gene conserved domains are underlined.

表2 鳜与其他脊椎动物LBD结构域氨基酸序列同源性比较 Table 2 Amino acid homology comparisonof LBD domain between Chinese perch and other vertebrates

黑色方块表示 “WSXWS”基序；箭头位置指示终止密码子； TM:跨膜区。The black bar means “WSXWS” motif; arrows indicates the location of stop codon; TM:Transmembrane domain.

2.3 lepr氨基酸序列多重比对和进化树分析

鳜lepr-L亚型的LBD序列与其他物种氨基酸序列多重比对发现，鳜与石斑鱼、罗非鱼和欧洲鲈同源性最高(75%～87%)，其次是虹鳟和大西洋鲑(48%)，与斑马鱼、黑鲫、小鼠和人同源性最低(31%～42%)(图3)。

黑色底纹表示氨基酸序列一致 Black shading indicates that the amino acid sequence is consistent.

比对16个不同物种的lepr氨基酸序列并构建系统进化树。如图4所示，lepr进化树整体分为2支，哺乳动物和两栖动物的lepr聚为一支，鱼类的lepr聚为另一支。鳜与鲈形目鱼类的lepr的亲缘关系最近，其次为鲑鳟类，与鲤科鱼类的亲缘关系最远。

图4 脊椎动物lepr氨基酸系统进化树

2.4 lepr在鳜各组织中的表达情况

图5所示为lepr-L在鳜各组织器官中的表达情况。在鳜中，lepr-L在鳃中表达量最高，其次是肾、垂体、肠、脾、脂肪组织、心、肝、中脑、下丘脑和小脑，在小脑和端脑中表达量最低。

T：端脑 Telencephalon； M：中脑 Midbrain； C：小脑 Cerebellum； P：垂体 Pituitary； Ht：下丘脑 Hypothalamus； MO：延脑 Medulla oblongata； L：肝脏 Liver； I：肠 Intestines； K：肾脏 Kidney； A：脂肪组织 Adipose； G：鳃 Gill； S：脾脏 Spleen； H：心脏 Heart.

2.5 腹腔注射鳜leptin A和leptin B同源重组蛋白对脑lepr-L表达的影响

图6所示为腹腔注射鳜同源重组leptin A和leptin B 2 h和4 h后，脑组织中lepr-L的表达情况。注射leptin A 2 h和4 h对鳜脑组织中lepr-L的表达均无显著影响(P>0.05)；注射leptin B 2 h鳜脑组织中lepr-L的表达水平显著上调(P<0.05)，注射leptin B 4 h后未观察到鳜脑组织中lepr-LmRNA丰度的显著变化(P>0.05)。

含有不同字母的组别之间存在显著性差异(P <0.05)，数据以平均值±标准误表示(n=6)。Values within the same row with superscripted letters represent significant difference (P<0.05),data are expressed as mean±S.E (n=6).

3 讨 论

本研究采用3′ RACE克隆的方法，获得了由mRNA 3′端可变剪切产生鳜的4种lepr亚型，包括1个长受体亚型和3个短受体亚型。氨基酸多重比对和进化树分析发现，鳜lepr及其LBD区域均较为保守，与同属鲈形目的欧洲鲈和石斑鱼的同源性最高，亲缘关系最近，其次是鲤科鱼类，与两栖动物和哺乳动物的同源性较低，亲缘关系最远。这与在其他鲈形目鱼类中得到的结果相一致[8,11,24]。

本研究中使用3′ RACE克隆得到鳜的4种亚型的lepr，与哺乳动物和其他鱼类一致的是，长型受体亚型lepr-L具有完整的功能结构域，包括：信号肽、LBD、FNIII，重复的WSXWS、Ig-C2-like、跨膜区、细胞膜内的JAK-STAT结构域。鳜lepr-S1含有LBD，完全缺失了跨膜结构域和胞内域，推测其可能是可溶性leptin受体。在哺乳动物和鱼类中，可溶性受体与循环瘦素结合，避免瘦素被降解，进而调节瘦素的浓度和活动[9,23,25]。鳜短受体亚型lepr-S1结构与哺乳动物和虹鳟的可溶性受体相似，我们推测鳜短受体亚型lepr-S1应当具备分泌型受体的功能，可能具备调节血浆leptin浓度的功能。而鳜短型受体亚型lepr-S2和lepr-S3仅含有一个WSXWS，未见其他重要结构域，在其他鱼类中均未见报道类似的短型受体亚型，其生理功能还需进一步探究。

在鱼类中，lepr在各组织中的表达分布情况与物种相关，例如在金鱼[26]、欧洲鳗鲡[27]和大西洋鲑[12]的端脑、下丘体和性腺中lepr表达量最高，在罗非鱼的垂体中lepr表达最多，其次是肌肉和头肾[26]，日本青鳉的lepr则在肌肉中表达量最高，其次是皮肤和鳃[6]。在我们的研究中，鳜lepr-L在鳃中表达最高，其次是肾脏和垂体。此类lepr组织表达分布的差异可能说明leptin在不同的物种中发挥的作用不尽相同。

在哺乳动物中，leptin作为一种饱食因子，通过与专一性受体lepr结合发挥其抑制食欲的生理功能[14-15]。草鱼[28]、鳜[22]、罗非鱼[29]等鱼类腹腔注射同源重组的leptin蛋白后均表现出食欲降低，因此，leptin在鱼类中也被认为具有抑制食欲的作用。同时，敲除lepr基因的日本青鳉也表现出食欲增强[30]，也验证了上述观点。然而，lepr敲除的斑马鱼却未表现出食欲的增加[31]。在我们的研究中发现，腹腔注射鳜leptin B同源重组蛋白2 h后，鳜食欲显著降低[22]，脑中lepr的表达量随之升高，在注射4 h后，鳜食欲恢复的同时[22]，脑中lepr的表达量也随之降低；而注射鳜leptin A同源重组蛋2 h及4 h后，既未观察到食欲明显降低[22]，也未观察到脑组织中lepr表达的变化。由此，我们推测，鱼类不同的leptins在不同的组织中对lepr表达的影响不一致，从而行使不同的生理功能。

本研究首次克隆出由mRNA 3′端可变剪切产生的鳜lepr的4个受体亚型。经序列分析发现，仅长型受体lepr-L具有完整的功能结构域，且各功能结构域的氨基酸序列高度保守。短型受体亚型lepr-S1完全缺失跨膜区域和胞内结构域，推测其为可溶性受体亚型，发现了2个在其他鱼类中未见报道的、仅具备1个WSXWS结构的lepr短型受体亚型。鳜lepr基因在鳃、肾和垂体中表达量较高；注射鳜leptin B而非leptin A的同源重组蛋白会引起脑lepr表达量上升。这些结果说明鳜leptins能引起组织中lepr的表达的不同变化而发挥独特的生理功能。