hCG日孕酮过高或过低对年轻全胚冷冻患者周期累积活产率的影响

詹少泉 郑海燕 曹明珠 刘见桥 毛玉玲 龙晓林 刘寒艳

1广州医科大学附属第三医院妇产科，生殖医学中心，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省生殖医学重点实验室（广州510150）；2浙江大学医学院附属第一医院生殖医学中心（杭州310003）

在常规的体外受精（IVF）周期中，人绒毛膜促性腺激素（hCG）给药当天的孕酮（P4）升高［1］对新鲜周期的子宫内膜环境有不利影响［2］，导致妊娠率降低［1，3-4］。而hCG 日孕酮水平升高对卵母细胞或胚胎质量的影响，存在争议。有研究认为，hCG日孕酮升高导致胚胎质量受损［5-6］，降低累积活产率［7-8］，其他研究则认为对胚胎质量［1，4］和累积活产率均无影响［9］。此外，当hCG 日孕酮水平过低（＜0.5 ng/mL）对新鲜周期活产率有影响［10-11］，但是对全冻周期活产率以及累积活产率的影响尚无相关报道。因此，本研究的目的是通过评估hCG 日孕酮水平过高或过低对年轻全胚冷冻患者冻融胚胎移植（FET）后累积活产率的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年1月至2018年12月期间行全胚冷冻的周期，根据新鲜周期hCG 日孕酮水平的不同进行回顾性分析。纳入标准：取卵年龄≤35 岁，第1 次IVF 周期，拮抗剂方案或者激动剂方案。 排除标准：微刺激或自然周期，IVF+RICSI，IVF+ICSI 周期，PGT 周期，卵子冷冻周期，二次冷冻周期，未获得活产但仍有冻存胚胎未移植者，失访或结局指标缺失者。同一组中每名患者只纳入一次统计。该研究征得患者知情同意并获得医院伦理委员会的批准。基线资料包括患者的取卵年龄、不孕年限、身高、体质量指数、抗苗勒氏激素（AMH）、基础FSH（bFSH）、基础LH（bLH）、原发不孕比例以及不孕因素分布。

1.2 分组有研究认为P4 ＞1.14 ng/mL时，新鲜移植会影响活产率［12］，而P4在0.5 ～1.2 ng/mL时，活产率最高［10-11］。参考既往研究［3-4］应用的临界值划分，根据hCG日孕酮水平将3 923例患者分为四组：组1（＜0.50 ng/mL，n= 801），组2（0.50 ～1.14 ng/mL，n= 1 626），组3（1.15 ～1.49 ng/mL，n= 499）和组4（≥1.50 ng/mL，n=997）。组2 为对照组。

1.3 方法

1.3.1 卵巢刺激和胚胎冷冻标准采用GnRH 激动剂方案或GnRH 拮抗剂方案［13］，当至少两个卵泡直径＞17 mm 时，用4 000 ～10 000 IU 的hCG（丽珠，珠海丽珠）或重组HCG（艾泽，瑞士默克雪兰诺）诱导最终的卵母细胞成熟。在hCG 日进行孕激素测定，空腹取肘静脉血5 mL，采用全自动电化学发光免疫分析仪（雅培i4000SR）检测。hCG 触发后34 ～36 h 进行卵母细胞采集。

第3 天冷冻胚胎评分标准为：5 ～12 个细胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一或不完全均等大小，＜50%空泡，＜50%多核。第3 天优质胚胎标准为：7 ～9 个细胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一，无空泡或多核。根据患者情况以及知情同意，在第3 天冷冻0～4 个胚胎，剩余胚胎行囊胚培养，在囊胚阶段，根据Gardner 分类法在第5、6 天评估胚胎质量。囊胚在3～6 级扩张、ICM 和TE 的发育至少达到一个B 级或以上时冷冻。3 ～6 级，ICM 和TE均不含C 级时为优质囊胚。

1.3.2 FET 内膜准备、玻璃化冷冻和复苏准备冷冻胚胎移植的患者根据月经和排卵情况采用自然周期或人工周期。玻璃化冷冻和复苏采用商品化试剂盒（日本，加藤），卵裂胚冷冻在室温下进行，ES 液中5 min，VS 中45 ～60 s。囊胚在玻璃化冷冻之前，先进行激光人工囊胚皱缩，冷冻过程在37 ℃下，ES 液中2 min，VS 中45 ～60 s。然后用最小体积的玻璃化溶液将胚胎装载到冷冻载体Cryotop 顶端，并立即在-196 ℃下浸入液氮中。卵裂胚和囊胚复苏过程相同，复苏时，迅速将Cryotop顶端置于37 ℃的TS 中1 min，然后在室温下依次将胚胎转入DS、WS1、WS2 中各3 min。最后将存活的胚胎移入平衡过的培养液中，置于37 ℃、6%CO2的培养箱中培养等待移植。培养2 ～4 h 后在超声引导下进行宫内移植。

1.4 观察指标观察指标包括新鲜周期卵巢刺激情况、胚胎培养情况以及全冻周期首次移植的活产率和累积活产率。活产，是指胚胎移植后在妊娠≥28 周时产下一个存活的婴儿。累积活产，是指一次促排卵周期后的冻融移植周期获得至少一次活产。至2020年12月如患者未获得活产但仍有剩余的未移植的冷冻胚胎，则不纳入统计，多次活产仅纳入首次活产周期。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，对于正态或非正态分布资料分别采用两独立样本t检验或Mann-Whitney′sU检验，计数资料用例（%）表示，采用χ2检验或Fisher精确概率计算法。结局指标进行单因素和多因素回归分析，校正混杂因素，分析影响结局的相关因素。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者新鲜周期的基础参数情况各组间取卵年龄、不孕年限、身高、体质量指数、AMH、bFSH、bLH、原发不孕比例以及不孕因素分布差异均无统计学意义。见表1。

表1 患者新鲜周期的基础参数情况Tab.1 Basic parameters in the fresh cycles included ±s

表1 患者新鲜周期的基础参数情况Tab.1 Basic parameters in the fresh cycles included ±s

指标例数取卵年龄［例（%）］≤25 岁26～30 岁31～35 岁不孕年限（年）身高（cm）体质量指数（kg/m2）抗缪勒氏激素（ng/mL）bFSH（U/L）bLH（U/L）原发不孕［例（%）］不孕因素［例（%）］输卵管盆腔因素排卵障碍子宫内膜异位症男性因素双方因素组1（＜0.5 ng/mL）801 29.31±2.97 90（11.24）425（53.06）286（35.71）3.97±2.31 158.62±4.41 21.40±3.14 7.82±4.62 4.97±1.25 4.86±3.98 471（58.80）393（49.06）82（10.24）16（2.00）123（15.36）187（23.35）组2（0.5 ～1.14 ng/mL）1 626 29.48±3.02 154（9.47）854（52.52）618（38.01）3.99±2.37 158.40±4.56 21.33±3.04 7.54±4.45 5.07±1.28 4.57±2.87 921（56.64）783（48.15）143（8.79）22（1.35）263（16.17）415（25.52）组3（1.15 ～1.49 ng/mL）499 29.74±2.89 42（8.42）245（49.10）212（42.48）3.86±2.38 158.14±4.62 21.47±3.05 7.19±4.40 5.08±1.48 4.48±3.09 274（54.91）228（45.69）49（9.82）11（2.20）83（16.63）128（25.65）组4（≥1.5 ng/mL）997 29.52±2.71 82（8.22）518（51.96）397（39.82）3.93±2.32 158.20±4.95 21.27±3.01 6.93±5.25 5.11±1.35 4.47±3.03 569（57.07）488（48.95）73（7.32）24（2.41）172（17.25）240（24.07）P 值0.087 0.118 0.687 0.158 0.632 0.075 0.174 0.138 0.565 0.409

2.2 患者新鲜周期的卵巢刺激、胚胎发育情况组1 与组2（对照组）相比，Gn 启动量、hCG 日E2 水平、获卵数和冷冻胚胎数均显著下降，优质胚胎率和冷冻胚胎率显著增加（均P＜0.01）。组3 与组2（对照组）相比，Gn 总量显著增加（P＜0.05）。组4与组2（对照组）相比，Gn 启动量、Gn 总天数和Gn总量均显著增加，优质胚胎率和冷冻胚胎率显著下降（均P＜0.01）。新鲜周期全胚冷冻原因在各组间差异均有统计学意义（P＜0.001），组1、组2和组3 冷冻主要原因为预防卵巢过度刺激综合征（OHSS），组4 冷冻主要原因为生化指标异常（如E2 升高，P4 升高等），其次为预防OHSS。见表2。

表2 患者新鲜周期的卵巢刺激、胚胎发育情况Tab.2 Ovarian stimulation and embryo development in the fresh cycles included ±s

表2 患者新鲜周期的卵巢刺激、胚胎发育情况Tab.2 Ovarian stimulation and embryo development in the fresh cycles included ±s

注：Gn 为促性腺激素；HCG 为绒毛膜促性腺激素；E2 为雌二醇；OHSS 为卵巢过度刺激综合征；ICSI 为卵胞浆内单精子显微注射；IVF为体外受精；与组2 对比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

指标例数促排方案［例（%）］激动剂方案拮抗剂方案Gn 启动量（IU）Gn 总天数Gn 总量（IU）HCG 日E2（pmol/L）新鲜周期全胚冷冻原因［例（%）］预防OHSS盆腔或宫腔因素血清生化指标异常个人因素其他因素授精方式［例（%）］ICSI IVF获卵数优质胚胎数优质胚胎率［例（%）］冷冻胚胎数冷冻胚胎率［例（%）］组1（＜0.5 ng/mL）801 610（76.15）191（23.85）147.09±42.06*11.99±2.60 1 865.88±757.48 15 294.70±4 261.56***668（83.40）89（11.11）4（0.50）10（1.25）30（3.75）146（18.23）655（81.77）17.65±7.12***3.73±3.09 2 984（35.41）**8.35±5.09 **6 691（62.26）***组2（0.5 ～1.14 ng/mL）1 626 1 226（75.40）400（24.60）152.15±40.42 11.93±2.37 1 937.35±721.27 16 788.22±2 884.48 1 409（86.65）130（8.00）36（2.21）18（1.11）33（2.03）307（18.88）1 319（81.12）20.06±7.19 3.93±3.30 6 396（33.34）9.16±5.18 14 893（60.61）组3（1.15～1.49 ng/mL）499 379（75.95）120（24.05）157.00±39.69 12.09±2.22 2 051.86±776.92*16 754.91±2 908.95 400（80.16）28（5.61）62（12.42）3（0.60）6（1.20）84（16.83）415（83.17）20.44±7.74 3.91±3.41 1 951（31.73）9.44±5.49 4 709（59.28）组4（≥1.5 ng/mL）997 735（73.72）262（26.28）167.07±45.55***12.49±2.36***2 299.96±925.12***16 487.30±3 167.09 178（17.85）16（1.60）797（79.94）4（0.40）2（0.20）191（19.16）806（80.84）20.70±9.30 3.71±3.42 3 696（31.43）**8.82±5.74 8 798（58.42）***P 值0.627＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.708＜0.001 0.254＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 全冻策略后首次FET 周期情况及累积活产率与对照组相比，组1、组3 和组4 中首次FET 的胚胎数、时间、移植优质胚胎周期比例、内膜厚度和自然周期比例以及首次移植活产率差异均无统计学意义（P＞0.05）。组4 累积活产率显著低于对照组（69.71%vs. 75.83%，P＜0.01），组1、组3 累积活产率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。组4 各年龄段累积活产率最低，组2 最高，年龄分层后的累积活产率见图1。全冻策略后首次FET周期情况及累积活产率见表3。

表3 全冻策略后首次FET 周期情况及累积活产率Tab.3 First FET cycle and cumulative live rate after freeze-all strategy例（%）

图1 年龄分层后的P4 各组累积活产率Fig.1 Cumulative live birth rate in different P4 groups after age stratification

2.4 多因素回归分析P4对全冻周期累积活产率的影响校正年龄、不孕年限、可利用胚胎数、授精方式后发现，取卵周期hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL仍显著降低累积活产率（OR= 0.759，95%CI：0.63～0.91，P＜0.01），P4 ＜0.5 ng/mL 不会影响全冻周期累积活产率（P＞0.05）。

3 讨论

P4 ≥1.5 ng/mL 是目前广泛使用的孕酮升高的阈值［3］，目前孕酮升高会通过降低子宫内膜容受性而对植入产生不利影响已达成共识［2，14-15］，因此全胚冷冻可以部分缓解这一问题。另有研究提出，提前升高的孕酮水平不仅对种植窗子宫内膜存在影响，对胚胎的发育也有负面效应［5-6］，认为孕酮增加与优质囊胚率降低有关［16］。本研究中也得到了相似的结果，P4 ≥1.5 ng/mL 组在年龄、获卵数与对照组相似的情况下，尽管优质胚胎数与冷冻胚胎数无明显差异，但是优质胚胎率和冷冻胚胎率显著下降。迄今为止，大多数研究者仅探讨新鲜周期hCG 日高孕酮水平对新鲜移植周期的影响［10］，以及在第一次冷冻胚胎移植的妊娠率，而不是累积妊娠率［17］。只有少数研究探讨了其对累积活产率的潜在影响［7-9］，且有研究纳入了包含新鲜移植周期的累积活产率［7-8］，而目前已经明确高孕酮对新鲜移植周期结局的负面影响，从而影响了累积活产率的准确性。本研究评估了新鲜周期hCG 日各孕酮水平对年轻患者全冻周期累积活产的影响，从而提高了结果的临床适用性。数据表明，当新鲜周期hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL，解冻周期首次活产率无差异，累积活产率降低，接着对取卵年龄等因素进行了校正后，P4 ≥1.5 ng/mL 对累积活产率仍产生影响，这也间接说明高孕酮对胚胎质量（而不仅仅是形态学质量）产生了影响，从而降低了累积活产率，虽然高孕酮影响胚胎质量的机制尚不清楚。

P4 1.0 ～1.49 ng/mL 组与对照组相比，和≥1.5 ng/mL 组一样，在获卵数与对照组相似的情况下，优质胚胎率和冷冻胚胎率差异无统计学意义，在未校正或校正其他因素后，全胚冷冻首次移植累积活产率差异也无统计学意义。说明在这个范围内的孕酮对胚胎质量并没有影响，也不会影响累积活产率。

与对照组相比，低孕酮组（P4 ＜0.5 ng/mL）患者取卵年龄差异无统计学意义，获卵数较少，导致冷冻胚胎数较少，但是优质胚胎率和冷冻胚胎率显著增加，说明低孕酮并不会影响胚胎质量。之前的研究认为hCG 日低P4 水平与黄体生成减少和/或子宫内膜容受性改变有关［10］，从而导致新鲜移植周期活产率降低［10-11］。本研究发现，新鲜周期的低P4 水平并不会影响全冻周期的首次移植活产率和累积活产率，说明低P4 水平并不会影响胚胎质量。

本研究局限性主要为：（1）为避免其他潜在的混杂因素，本研究研究对象仅包括取卵年龄在≤35 岁、第1 次IVF 周期、拮抗剂方案或者激动剂方案的患者。（2）有研究认为P4 对高反应的患者移植结局影响更明显［11］，但是本研究并没有对不同卵巢反应的患者进行分析。（3）由于只纳入了年龄≤35 岁的患者，所以本研究结果是否适用于高龄患者还需要进一步研究。

综上所述，hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL 显著降低年轻患者全胚冷冻后的累积活产率，可能与高孕酮水平影响优质胚胎率和冷冻胚胎率有关，孕酮水平＜0.5 ng/mL 不会影响胚胎质量，也不会影响全胚冷冻周期的累积活产率。