超越CRISPR的新型基因编辑技术RLR

编译 希区客

2020年11月5日，以色列维茨曼研究所的罗特姆·索雷克（Rotem Sorek）团队在《细胞》（Cell）上发表论文证实一种名为反转录子（Retron）的细菌的遗传元件同样也是细菌抵抗噬菌体的防御系统。那么，反转录子能否像CRISPR一样，被开发成强大的基因编辑工具呢？2021年5月，哈佛医学院乔治·丘奇（George Church）领衔的团队在这方面有了新进展。

从CRISPR到重组工程

毫无疑问，CRISPR-Cas9基因编辑系统已成为合成生物学领域的创新典范，其带给人类的影响可用惊世骇俗来形容，但现阶段的它仍存在技术缺陷。其中一个极为关键的问题在于，虽然研究者可以通过某些设定，用CRISPRCas9寻找并切割特定的目标DNA片段，但切割之后的替换任务需要诱使细胞用新的DNA片段来修复断裂，而这一“诱导+替换”的过程很复杂，甚至对细胞造成伤害（因为Cas9经常还会切割计划外的位点，造成脱靶问题）。

近年来兴起的一项新型基因编辑技术——重组工程，似乎可弥补CRISPR的缺陷。它执行诱导和替换任务的方式是在细胞复制DNA时引入目标基因片段。所谓“复制”，即DNA的半保留复制过程本就是模板单链持续配对碱基最终合成出完整双链分子的过程，因此在这一过程中引入目标突变基因是相当安全的。相比常规CRISPR的“强行替换”，重组工程选择的“偷梁换柱”可以说是在不破坏DNA的情况下有效地产生了基因突变。下图为该过程的示意图。

反转录子重组过程示意图：将含有目标突变（图中的黑色小段）的反转录子序列与反转录酶（RT）一起引入细菌细胞。接着，反转录子序列由双链分出单链，单链DNA借助另一种称为单链退火蛋白（SSAP）的酶插入需要引入突变的DNA序列中

此种方法简单便捷，可同时在许多细胞内开展，以尽可能短的时间创建出尽可能复杂多样的突变库，从而为研究人员分析所用。然而有另一个问题无法忽视：大量的突变可以在短时间内生产，但想弄清楚它们具体是什么，那就需要对每个突变体进行分离、测序和表征，而这是一项极为耗时费力的任务。

将重组工程升级为RLR

在此背景下，哈佛大学的Wyss研究所和哈佛医学院的研究人员创建了一种基于反转录子的新型基因组编辑工具，并将其命名为“反转录子库重组工程”（RLR）。RLR让整个任务变得容易：一方面，它和普通的重组工程技术差不多，可同时生成多达数百万个突变，快捷高效；另一方面，RLR不只产出突变，更能给突变“编码”（我们可以将它类比为商品的条形码），这便于研究者一次性地快速筛查整个基因突变池（更通俗地说就是查找变异基因的速度大大加快），进而轻松生成并分析大量数据。

已有科学家使用RLR技术在细菌细胞中完成了“百万量级”的基因编辑，并于2021年5月4日在《美国国家科学院院刊》（PNAS）发表论文介绍了他们的工作。

论文作者之一、Wyss研究所的博士后麦克斯·舒伯特（Max Schubert）表示：“RLR让我们有能力开展CRISPR无法完成的任务。我们随机‘切碎’一个细菌的基因组，将基因片段原位转化为单链DNA，并同时筛选数百万个序列。RLR是一种更简单也更灵活的基因编辑工具，可用于高度重复的实验，这使得它不仅不像常规的CRISPR那样具有伤害性，还可大大助力研究人员在基因组水平上探索突变。”

反转录子是细菌的DNA片段，可通过反转录产生单链DNA（ssDNA）片段。科学界发现反转录子已有数十年历史，但这数十年来，研究人员一直不了解反转录子产生的ssDNA有什么用。直到2020年6月，终于有团队发现原来单链DNA可以检测出病毒是否感染了细胞，它是细菌免疫系统的一份子。

最初人们只把反转录子视为细菌的某种特例，但过去几年间，越来越多科学家都将目光投向了这一特例，认为反转录子有望如CRISPR那般，在细菌、酵母菌甚至人类细胞的基因编辑方面大展拳脚。

如前文所述，将包含目标突变的单链DNA片段整合至原有基因组的方式有两种。一种是CRISPR-Cas9常用的先切割后替换，另一种则是重组工程技术（包括更高效的RLR）选择的复制过程引入策略：先把突变序列引入细胞，令其分作单链，再借助单链退火蛋白把突变整合到基因组中。

新研究的第一作者、加州大学旧金山分校博士后研究员丹尼尔·古德曼（Daniel Goodman）指出，反转录对基因编辑的升级是革命性的。正因为它，我们才能先把双链序列引入等待编辑的细胞，接着等待双链自己分解成单链，最后完成替换——而不必选择强行把单链导入细胞，不必破坏天然DNA，这着实妙。

反转录的另一个吸引人之处在于它们的序列本身可用作“条形码”，以识别细菌池中的哪些个体已经接收到了哪些反转录子序列，进而帮助研究者极为快速地汇总筛选突变菌株。

搭建RLR体系的全过程

为确认反转录子是否能实现高效的基因重组，舒伯特和同事首先创建了细菌DNA的环状质粒，该质粒包含位于反转录子序列中的抗生素抗性基因，以及一个单链退火蛋白（SSAP）基因。他们将这些反转录子质粒插入大肠杆菌，待其经过20代细胞复制后，观察抗生素抗性基因是否成功整合至大肠杆菌的基因组中。他们一开始的观察结果并不理想，整合成功的大肠杆菌的比例低于0.1%。

为提高成功率，研究团队对细菌质粒进行了几项调整。一方面，他们令细菌的自然错配修复机制（可纠正DNA复制错误）失活，这保证了突变不会在遗传给下一代之前“修复”。另一方面，他们还灭活了细菌的两个编码核酸外切酶（可破坏自由浮动的ssDNA）基因。这些变化极大地增加了成功整合反转录序列的细菌比例——从原来低于0.1%增至90%以上。

在反转录子的基因整合方面大获成功后，舒伯特团队开始测试可否将反转录子用作基因测序的“捷径”——由于每个细菌质粒都有自己独特的反转录序列，这些序列可以充当“标签”（或者说是“条形码”）。

此前已经介绍过，所谓的RLR技术就是切开细菌的基因组，将其中某个基因片段原位转化为单链DNA，并用它们一次性筛选数百万个序列。这里用于筛选的片段就是那个关键的“条形码”，即细菌质粒内某段独特的反转录序列。而用RLR筛选的优势在于它免去了检测细菌全基因组的海量工作，只测那段短得多的反转录序列即可确定细胞已经接受了哪些突变。

舒伯特团队的构想相当完美，那么在实操层面，他们是如何打造自己那一套神奇的RLR条形码筛查体系的呢？

首先，他们测试了RLR技术能否检测出大肠杆菌体内已知的抗生素耐药性突变，结果发现，包含耐药性突变的序列相比其他突变在测序数据中的存在比例高得多；同时他们还确定，RLR具有足够的灵敏度和精确度，可测量由非常相似的突变所引起的耐药性方面的微小差异；更为重要的是，通过特定“条形码”筛查整个细菌基因池（而非对单个突变体进行分离测序）寻找目标突变的效率极高。

接着，研究团队更进一步，尝试确定RLR能否用于随机片段化的DNA检测筛查，以及他们一次可使用多少个反转录子。舒伯特等人切碎了对另一种抗生素具有高度耐药性的大肠杆菌菌株的基因组，并利用这些片段建立了一个包含数千万条基因序列（均来自质粒反转录子序列）的库。之后，他们将该基因库引入经RLR优化的大肠杆菌菌株中进行分析，结果再一次发现，对细菌基因库进行测序筛查，可以很容易地识别出赋予耐药性的反转录子片段。

论文的通信作者、著名合成生物学家乔治·丘奇表示：“我们能够通过RLR技术，基于 ‘条形码’来分析整个突变库，这让同时开展数百万次实验成为现实，也帮助我们能够观察到整个基因组突变的影响，以及这些突变之间如何相互作用。这项工作有助于建立在其他遗传系统中使用RLR的路线图，为未来的遗传研究打开了许多令人兴奋的可能性。”

资料来源 harvard.edu