长期施肥对红壤稻田土壤微生物生物量和酶活性的影响*

夏文建，柳开楼，张丽芳，刘 佳，叶会财，邓国强，李大明，李祖章，王 萍，李 瑶，杨成春，彭春瑞，陈 金†

（1. 江西省农业科学院土壤肥料与资源环境研究所/农业农村部长江中下游作物生理生态与耕作重点实验室/国家红壤改良工程技术研究中心，南昌 330200；2. 江西省红壤研究所，南昌 330046）

在农田生态系统养分循环中，土壤胞外酶活性（extracellular enzyme activities，EEAs）与土壤功能密切相关，能够反映土壤养分状况，是表征土壤肥力和土壤质量的重要指标之一[1-2]。同时，土壤胞外酶活性与土壤微生物活动密切相关，可以较为全面地反映土壤微生物群落的功能特征，在土壤生态系统和土壤质量评价中受到广泛关注[3]。施肥[4-5]，特别是氮[6-7]、磷[8]等养分投入对土壤酶活性的影响已有较多研究，一般认为养分的投入会增加土壤微生物生物量，刺激微生物产生对应的酶，引起土壤胞外酶活性的增加，尤其以化肥和有机肥配施的效果最佳[9-11]。

魏亮等[12]研究了水稻不同生育期根际与非根际EEAs对施氮的响应，发现根际和非根际影响胞外酶活性的因素不同，土壤酶活性与多种环境因子存在复杂关系。在长期不同比例有机肥替代化肥的试验条件下，土壤碳氮比是影响EEAs的主要因素之一[13]。而长期施用化肥和不同有机肥处理条件下，EEAs与水溶性有机碳之间有更强的相关性[14]。调控物质循环的水解酶或氧化还原酶活性受到了对应的土壤养分状况影响[14-15]。然而，由于供试土壤和试验环境的差异，不同研究者所获得的研究结果不尽一致。现有研究更关注长期施肥对土壤养分和微生物群落的影响[16]，对于土壤生物活性和功能研究相对较少，或者仅选择2～3种土壤胞外酶描述土壤功能[8，12]，关于长期施肥对土壤碳、氮、磷等养分物质循环相关胞外酶活性总体分布特征的研究不多。土壤胞外酶活性可以较为全面地指示土壤生境变化和生态功能特征，且对土壤环境变化敏感[1，17]。因此，开展长期施肥土壤胞外酶活性特征及与环境因子的关系研究，对于深入理解碳、氮、磷等养分物质循环过程具有重要意义[17-18]。

为了研究长期施肥对红壤稻田土壤胞外酶活性（EEAs）的影响及其驱动因子，本文利用持续了37 a的长期定位试验，采用微孔板荧光法测定了土壤α-葡萄糖苷酶（AG）、β-葡萄糖苷酶（BG）、纤维素水解酶（CBH）、乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、酸性磷酸酶（ACP）和酚氧化酶（POX）等6种酶，涵盖了土壤C、N、P等养分循环和有机物氧化，同时分析了土壤化学指标和土壤微生物生物量碳氮，通过主成分分析和冗余分析探讨土壤胞外酶分布特征及其与土壤养分和微生物生物量的关系，以期解析长期施肥影响EEAs特征的关键因子，为红壤稻田肥力培育提供微生物酶学方面的理论参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

红壤稻田长期定位试验位于进贤县张公镇江西省红壤研究所（116°20′24″N、28°15′30″E）。平均海拔30 m，属中亚热带季风气候，年均气温17.6 ℃，有效积温5 528 ℃；年降水量1 785 mm，无霜期约280 d，日照时数1 950 h。

长期定位试验始于1981年[19]，种植制度为双季稻。供试土壤为第四纪红色黏土发育的水稻土。试验前土壤耕层基础肥力状况为：土壤pH 6.9，有机碳16.3 g·kg-1，全氮1.49 g·kg-1，全磷0.48 g·kg-1，全钾10.39 g·kg-1，碱解氮150.4 mg·kg-1，有效磷4.15 mg·kg-1，速效钾80.52 mg·kg-1。

1.2 试验设计

本研究选择长期定位试验中的4个处理，分别为：不施肥（CK）、化肥（NPK）、2倍氮磷钾（HNPK）和氮磷钾+有机肥（NPKM）。小区面积46.67 m2，3次重复。每季施肥量：氮肥纯N 90 kg·hm-2，磷肥P2O545 kg·hm-2，钾肥K2O 75 kg·hm-2，有机肥22 500 kg·hm-2。肥料品种氮肥为尿素，磷肥为钙镁磷肥，钾肥为氯化钾。有机肥早稻为紫云英，晚稻为猪粪。根据多年结果计算[19-20]，紫云英和猪粪带入的纯氮、P2O5、K2O分别为27 kg·hm-2、17.0 kg·hm-2、28.5 kg·hm-2和 33.8 kg·hm-2、58.0 kg·hm-2、33.9 kg·hm-2。氮肥60%作基肥，剩下的40%于水稻返青后作追肥施用；钾肥全部于水稻返青后作追肥施用；磷肥和有机肥全部作基肥。所有小区的播种、移栽、灌溉和打药等日常管理措施与当地习惯相同。

1.3 研究方法

2017年晚稻收获后，每小区S型采集0～20 cm耕层土壤样品。按四分法分出1/2鲜样分析土壤胞外酶活性和微生物生物量，剩余1/2样品摊匀风干，磨细过筛分析土壤理化性质。水稻产量为周年早稻和晚稻产量之和，由小区实测产量换算。

土壤化学性质采用常规实验方法测定[21]：土壤pH（2.5︰1）采用酸度计电位法；土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾外加热法测定。全氮（TN）用半微量凯氏法测定；全磷（TP）用碱熔－钼锑抗比色法测定；碱解氮（AN）用碱解扩散法测定；有效磷（AP）用Olsen法测定；速效钾（AK）用1 mol·L-1NH4OAc浸提－火焰光度法测定。土壤微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸培养法测定[22]。

土壤胞外酶活性采用96微孔酶标板荧光分析法测定[23]。AG、BG和CBH催化葡萄糖和纤维素水解，是与土壤碳循环有关的酶；NAG催化几丁质和肽聚糖水解，是与土壤氮循环有关的酶；ACP催化有机磷水解，是与土壤磷循环有关的酶；POX催化酚类物质氧化，是与土壤腐殖化过程等相关的酶[16，24]。用甲基伞形酮（4-methylumbelliferyl，4-MUB）作为底物标示水解酶活性，用 L-二羟苯丙氨酸（L-3,4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）为底物标示酚氧化酶（POX）活性，利用多功能酶标仪在激发波长365 nm、发射波长450 nm的条件下测定。测定的6种土壤胞外酶的名称、缩写、功能、底物和国际酶学委员会编码（EC编码）见表1。

表1 土壤胞外酶名称、缩写、所用底物和国际酶学委员会编码Table 1 Names，abbreviations，substrates used and International Enzyme Commission number of the soil extracellular enzymes involved in the study

1.4 数据处理

试验数据用Excel 2016整理、计算和绘图，图表数据为平均值和标准误（SE），运用SPSS 17.0进行相关性分析、单因素方差分析和差异显著性检验（最小显著差异（LSD）法，P＜0.05）。采用Canoco 5.0软件进行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）。

2 结 果

2.1 长期施肥对土壤化学性质和水稻产量的影响

经过37 a的长期不同施肥处理，土壤化学性质和水稻产量发生了显著变化（表2）。与CK处理相比，NPK处理显著提高了土壤SOC、AN和AP含量，HNPK处理显著提高了土壤SOC和氮、磷、钾养分含量；与NPK处理相比，HNPK处理显著提高了土壤TP、AP和AK；而NPKM处理与HNPK处理相比，显著提高了SOC和氮、磷、钾等养分含量。与CK处理相比，施肥处理土壤pH均有所下降，但未达到显著水平。各施肥处理周年水稻产量较CK处理增加了81.4%～158.4%。

表2 长期施肥下的土壤化学性质和水稻产量Table 2 Soil chemical properties and rice yield of the paddy fields under long-term fertilization

2.2 长期施肥对土壤微生物生物量的影响

长期施肥土壤MBC和MBN呈增加的趋势（图1）。NPK处理土壤MBC和MBN较CK处理增加了20.8%和33.6%；与CK相比，HNPK和NPKM处理显著提高了土壤MBC和MBN（P＜0.05），其中，HNPK处理土壤MBC和MBN分别增加了41.1%和42.9%，NPKM处理则分别增加了60.2%和60.4%。

2.3 长期施肥对土壤胞外酶活性的影响

长期施肥改变了土壤EEAs状况（表3），不同土壤胞外酶对施肥的响应存在差异。与不施肥（CK）相比，NPK处理显著提高了AG和NAG活性；HNPK处理显著提高了AG和NAG活性，显著降低了ACP和POX活性；NPKM处理AG、BG、NAG和ACP活性分别提高12.7%、41.1%、36.2%和50.0%，POX活性显著下降29.7%（P＜0.05）。各施肥处理CBH活性略有增加，但处理之间差异均不显著。

表3 长期施肥下的土壤胞外酶活性Table 3 Activities of soil extracellular enzyme as affected by long-term fertilization

2.4 土壤胞外酶活性与土壤化学性质、微生物生物量和水稻产量的相互关系

土壤EEAs与土壤化学性质、微生物生物量和水稻产量的相关分析（表4）结果显示，土壤NAG活性与土壤微生物生物量（MBC和MBN）和水稻产量之间相关性达到显著水平，但与土壤养分之间相关性不显著；土壤BG活性与土壤SOC和氮、磷养分（TN、TP、AN和AP）之间相关性达显著水平；土壤CBH活性与土壤TN、MBC和速效养分（AN、AP和AK）之间相关性达显著水平；土壤ACP活性与土壤TN、AN、AP之间相关性达显著水平；土壤POX活性与除pH外的各指标均呈极显著负相关，而AG与各指标间相关性均不显著。可见，土壤EEAs受到了土壤养分和微生物影响，但不同胞外酶对土壤养分的响应存在较大差异。

2.5 土壤胞外酶活性分布特征及关键驱动因子

通过对6种土壤EEAs进行主成分分析，前两个主成分共包含了土壤EEAs分布特征的87.8%（图2）。长期不同施肥使EEAs分布产生差异，CK处理分布于上方中间部位，NPK处理分布在中心原点附近，HNPK处理主要分布在右下方，而NPKM处理主要分布在左下方。以土壤EEAs为响应变量，土壤化学性质、微生物生物量为解释变量进行RDA分析（图3）。RDA前两个排序轴保留了土壤胞外酶活性数据总方差的86.8%，即9个环境因子在前两轴中累计解释了土壤胞外酶活性特征的86.8%。响应变量与解释变量之间的箭头夹角的余弦值可以表示两者之间的相关性[25]，RDA排序图可以看出TN、AN、AP与BG、CBH、ACP之间呈正相关关系，MBC和MBN与NAG相关性较高，而土壤养分和微生物生物量与POX之间呈负相关关系，该结果与相关分析（表4）的结果一致。

表4 土壤胞外酶活性与土壤化学性质、微生物生物量和水稻产量的相关性Table 4 Correlations analysis of soil extracellular enzyme activities with soil chemical properties，microbial biomass and grain yield

各试验处理点在RDA图上的分布及与响应变量（EEAs）的位置关系可以看出，不施肥（CK）处理POX活性较高，NPKM处理主要提高了ACP、BG和CBH活性，HNPK处理主要提高了AG和NAG活性，而NPK处理胞外酶活性处于居中的位置。土壤EEAs的变化主要由土壤养分状况驱动，其中土壤全氮（TN）和微生物生物量碳（MBC）分别解释了方差变异的34.3%和20.9%，达到显著水平，表明长期施肥引起土壤酶活性的变化可以由TN和MBC这两个参数来解析。

3 讨 论

3.1 长期施肥对红壤稻田土壤养分和微生物生物量的影响

稻田长期均衡施用氮磷钾肥以及氮磷钾肥与有机肥配施有利于土壤肥力的提升，长期化肥配施有机肥使土壤SOC、TN、TP、AN和AP等养分显著增加[26]。本研究发现，与低量氮磷钾肥（NPK）相比，提高化肥用量（HNPK）对SOC、TN和AN的增加不显著，而有机无机配施（NPKM）显著提高了土壤有机碳和氮、磷、钾养分含量（表2），表明有机无机配施对于提升土壤养分具有更佳效果。Meta大数据分析也有相似的结论，与化肥处理相比，有机肥或有机无机配施处理作物产量平均增加27%、SOC增加38%、TN增加20%[11]。

土壤微生物生物量代表了参与土壤中养分循环和有机物质转化的微生物数量[27]，土壤MBC和MBN转化迅速，是敏感的土壤质量指标[27-28]，施用化肥可以提高土壤MBC和MBN。在不同利用方式土壤中的统计结果显示，与不施肥相比，长期施用化肥农田土壤MBC增加15.1%[2]，稻田土壤MBC和MBN分别增加26%和13%[10]；而有机肥投入具有更加显著的提升效果，与化肥处理相比MBC和MBN分别增加51%和24%[11]。本研究发现，与CK相比，NPK、HNPK和NPKM处理MBC分别增加20.8%、41.1%和60.2%，MBN分别增加33.6%、42.9%和60.4%（图1），表明土壤微生物生物量随化学肥料投入量在一定用量范围内呈递增趋势，而有机无机配施（NPKM）提升效果更为明显。

3.2 长期施肥对红壤稻田土壤胞外酶活性的影响

土壤胞外酶是土壤生态系统养分循环和代谢的主要驱动力，胞外酶活性反映了土壤的生物活性和生化反应的活跃程度[1-3]。土壤胞外酶活性对土壤环境因素敏感，不同研究者在不同区域和土壤上的研究结果存在较大差异。红壤旱地长期施用化肥或化肥与有机肥配施可以显著提高参与碳循环（BG、CBH）和氮循环（NAG）相关的水解酶活性[29-30]；稻田土壤施用化肥使参与碳循环水解酶BG活性较对照提高了35%～118%，参与氮循环水解酶NAG活性较对照提高了9%～30%[31]；而化肥配施有机肥可以进一步提高BG和NAG活性[31-32]。Meta分析也有相似的结论，化肥投入可增加AG、BG、CBH、NAG等酶活性[6，9]，有机肥投入促使相关酶活性大幅增加[11]。本研究发现长期施用化肥（NPK和HNPK）或有机无机配施（NPKM）提高了稻田土壤SOC和MBC（表2，图1），从而促进了AG、BG和CBH等碳循环相关水解酶的活性（表3）；施用化肥增加了土壤氮素养分含量（TN、AN和MBN）（表2，图1），提高了氮循环有关的NAG活性（表3），而有机无机配施（NPKM）处理土壤有效氮含量大幅增加，消减了土壤微生物代谢对氮素限制，使氮水解酶的分泌降低，导致NAG活性较高量化肥（HNPK）处理有所降低；低量氮磷钾（NPK）处理提高了土壤ACP活性，而高量氮磷钾（HNPK）处理降低了土壤ACP活性（表3），这可能由于高量无机磷投入抑制了解磷菌活性和酸性磷酸酶的合成与分泌，从而导致ACP活性下降[33-34]，而有机无机配施（NPKM）处理施用紫云英和猪粪，提供了丰富的碳源和有机磷，显著提高了ACP活性[35-36]。酚氧化酶（POX）参与木质素的降解与腐殖化过程[17]，荣勤雷等[32]长期有机培肥的数据显示不同肥料品种对土壤POX的影响存在差异，与不施肥相比，化肥配施畜禽粪便POX活性略有提高，单施化肥及化肥与绿肥或秸秆配施土壤POX活性均显著降低。长期定位研究发现，施用化肥或有机肥显著降低POX活性[14，16]；而Zhang等[37]在稻田短期试验的研究结果却显示增施有机肥提高了POX的活性，这可能与稻田有机物料腐解产生的还原物质短期内引起土壤微生物的响应有关。本研究中POX活性随化肥用量增加而下降，有机无机配施POX活性最低（表3），与前人研究结果[32-36]基本一致。

3.3 红壤稻田土壤胞外酶活性分布特征及其驱动因子

本研究通过对碳（AG、BG、CBH）、氮（NAG）、磷（ACP）循环相关的水解酶和氧化酶（POX）进行主成分分析，发现长期不同施肥处理造成土壤养分发生显著变化，从而显著影响了土壤EEAs的分布特征（图2）。土壤EEAs与养分之间存在典型相关关系[31]，EEAs的变化趋势与微生物生物量、有机碳和全氮的变化趋势基本一致[30]。Allison和Vitousek[38]研究认为微生物胞外酶的合成符合经济学理论，当微生物营养受到限制时会激发相应酶的分泌，而且土壤胞外酶活性与对应的功能基因数量有很强的相关性，两者之间的关系受到了土壤微生物结构、土壤有机碳、pH等调控[3]，但在不同土壤环境条件下，土壤EEAs的主要影响因素存在一定差异。本研究通过土壤EEAs与环境因子的RDA分析发现，EEAs的变化主要由土壤TN和MBC驱动，分别解释了酶活性变异的34.3%和20.9%（图3），表明氮素和有机物投入是影响红壤性稻田土壤EEAs的关键因素。

4 结 论

长期施肥显著影响了红壤性水稻土养分状况和微生物生物量碳氮，从而影响土壤胞外酶活性（EEAs），其中土壤全氮（TN）和微生物生物量碳（MBC）是关键的决定因子，分别解释了酶活性变异的34.3%和20.9%。化肥配施有机肥有利于水稻增产，并提高土壤养分、微生物生物量和土壤碳、氮、磷循环相关水解酶活性，是维持作物高产和提升土壤质量最优的施肥管理措施。土壤胞外酶活性EEAs是土壤质量的敏感指标，但土壤EEAs与环境因子之间关系、长期施肥对EEAs特征的影响及有关机制尚待进一步研究，特别是深入研究不同培肥措施引起的土壤胞外酶活性与土壤微生物数量、结构和功能变化之间的关系。

致 谢 感谢江西农业大学荣勤雷博士和江苏太湖地区农业科学研究所施林林博士在数据分析上给予的帮助。