湛江水产品中大肠埃希氏菌耐药性检测与分析

丁秀琼，黄 武，刘建芳，雷晓凌，麦嘉惠，黄健勇，聂芳红

( 1.湛江海关技术中心，广东 湛江 524000； 2.广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江 524088；3.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088； 4.水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088 )

亚历山大·弗莱明于1928年发现青霉对某些细菌生长具有抑制性，1939年霍华德·威廉·佛洛里和鲍里斯·钱恩首次提纯了青霉素并于1944年得以公开使用[1]。抗菌药物的发现为保证人类健康发挥了重要作用，但由于这类药物在临床治疗、畜牧业、水产养殖等方面的不合理使用甚至滥用，致使多重耐药细菌甚至超级耐药菌出现，严重威胁公共健康。《全球抗菌素耐药回顾》[2]报告指出，全球每年有70万人因为耐药微生物而死亡，预计到2050年，死亡数字会飙升到1000万，甚至超过癌症的死亡率。耐药细菌会通过多种方式进入环境，随后迁移到人类身上[3]。耐药基因在同种或不同种属细菌间转移传播使得细菌耐药性得以迅速产生及扩散[4-5]。细菌耐药性已成为全球公共卫生领域最复杂的威胁。

常见的多重耐药谱以耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、磺胺和氟喹诺酮类药物为主。细菌对β-内酰胺类药物产生耐药的主要机制是细菌产生了β-内酰胺酶，该酶水解本类药物的抗菌活性基团(β-内酰胺环)导致细菌对该类药物产生耐药。由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)具有更广的水解谱，携带该类ESBLs基因(主要为TEM型、CTX型、OXA型及SHV型)的细菌常呈现多重耐药表型，且易于在不同种属细菌之间随着耐药质粒的移动而散播[5]。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)中最常见的是携带CTX-M基因的质粒，已在中国及欧洲多个国家的人和其他动物体内检测到[6]。质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)自1998年在美国肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[7]中发现以来，在大肠埃希氏菌、假单胞菌(Pseudomonas)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、沙门氏菌(Salmonella)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)等越来越多的细菌中得到证实[6,8-12]。目前已报道的质粒介导的喹诺酮类耐药机制主要有3类，即qnr家族、aac(6′)-Ib-cr和喹诺酮类药物特异性外排泵qepA[13]。大肠埃希氏菌中最常见的是携带qnr基因的质粒，已在中国、法国、德国、丹麦、阿根廷、墨西哥等国家的人和动物体内检测到[6]。PMQR基因介导低水平耐药，但在喹诺酮类药物的选择压力下会导致高水平耐药性的产生[8]。而且携带PMQR基因的质粒通常还携带其他耐药基因(如ESBLs基因)，它们共同转移使受体细菌表现为对多种抗菌药物耐药[5,9,14-15]。

大肠埃希氏菌广泛分布于人类和温血动物的肠道内，通常对宿主无害[16]。但目前研究发现，大肠埃希氏菌耐药性已十分严重[13,17-18]，并因其常携带质粒、转座子和整合子等移动遗传元件，在抗性基因的传播中发挥重要作用[19-20]。世界卫生组织制定了《遏制抗微生物药物耐药性的全球战略》，并已在全球范围启动了若干监测系统，以收集用于今后抗生素耐药性风险评估的基础数据，建议监测的物种包括大肠埃希氏菌[21]。所以大肠埃希氏菌的耐药性及耐药性基因携带情况调查研究具有重要意义。

我国是世界水产养殖大国，2018年总水产养殖量超过5.0×107t，水产养殖产量占世界总量的78%以上，是世界上唯一养殖水产量超过捕捞总量的国家[22]。随着水产养殖业的不断发展，养殖用药量也随之增加。水环境及水生动物体内的细菌已发展出耐药性，成为耐药基因的储藏地，严重影响我国水产养殖的可持续发展[23-25]。目前，国内外关于水产品中大肠埃希氏菌耐药情况的报道较少[26-30]，而湛江地区尚未见相关报道。笔者通过对湛江地区水产品中大肠埃希氏菌耐药情况的检测分析，查明其耐药基因类型，旨在为指导水产养殖合理用药、水产品安全评价及抗生素耐药性风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

近江牡蛎(Crassostreaariakensis)、翡翠贻贝(Pernaviridis)、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、文蛤(Meretrixmeretrix)、华贵类栉孔扇贝(Mimachlamysnobilis)等鲜活样品均购自湛江某水产市场，产地湛江。样品购买后充氧并在1 h内运回实验室备检。冻罗非鱼片、冻熟对虾仁等冷冻样品为本实验室日常检测样品及湛江某水产公司提供。采样时间为2012年11月—2013年1月、2015年7月—2016年8月。按照GB 4789.38—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数》[31]的方法进行检测，必要时用VITEK2全自动微生物鉴定系统进一步鉴定确认。从686份样品中共检测得到52株大肠埃希氏菌(表1)。

表1 52株大肠埃希氏菌分离株编号及来源

1.1.2 主要试剂

二水合氯化钡、丙三醇、氯化钠、浓硫酸(广东光华科技股份有限公司)；营养琼脂、营养肉汤、Mueller-Hinton琼脂(MHA琼脂，北京陆桥技术有限责任公司)；Taq聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)；耐药基因上下游引物(上海生工生物科技有限公司合成)；GeneGreen核酸染料、100 bp DNA分子质量标准(天根生化科技有限公司)。

21种药敏纸片包括：青霉素类，哌拉西林(PRL，100 μg/片)；青霉素类+酶抑制剂，阿莫西林/克拉维酸(AMC，30 μg/片)；喹诺酮类，环丙沙星(CIP，5 μg/片)、氧氟沙星(OFX、5 μg/片)、诺氟沙星(NOR，5 μg/片)、左氧氟沙星(LEV，5 μg/片)、萘啶酸(NA，30 μg/片)；单环内酰胺类，氨曲南(ATM，30 μg/片)；磺胺类，复方新诺明(SXT，25 μg/片)；硝基呋喃类，呋喃妥因(F，30 μg/片)；氨基糖苷类，庆大霉素(CN，10 μg/片)、链霉素(S，30 μg/片)、阿米卡星(AK，30 μg/片)；四环素类，四环素(TE，30 μg/片)；第三代头孢菌素类，头孢噻肟(CTX，30 μg/片)、头孢他啶(CAZ，30 μg/片)；第四代头孢菌素类，头孢吡肟(FEP，30 μg/片)；大环内酯类，红霉素(E，10 μg/片)；酰胺醇类，氯霉素(CHL，30 μg/片)；以上均购自英国OXOID公司。头孢+酶抑制剂，头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLA，30/10 μg/片)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CLA，30/10 μg/片)，均购自美国BD公司。

1.1.3 主要仪器

SW-CJ-1F型洁净工作台(上海博迅实业有限公司)，SPX-250B-G型光照培养箱(上海博迅实业有限公司)，H1650-W型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，XW-80A型旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，Hema 9600PCR型基因扩增仪(珠海黑马医学仪器有限公司)，Gel Doc XR+型凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验

参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的翻译版M100-S23《抗菌药物敏感性试验执行标准(第23版资料增刊)》[32]指导原则和执行标准，用K-B纸片扩散法测定52株大肠埃希氏菌对19种抗菌药物的敏感性及产ESBLs菌株表型确证试验。在MHA平板上，同时贴头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸，头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。若两组药物中任意一组，在加入克拉维酸后，其抑菌圈比未加入克拉维酸的抑菌圈相比，其增大值≥5 mm，即判定该大肠埃希氏菌是产ESBLs菌株，以大肠埃希氏菌ATCC25922作为质控菌株。

1.2.2 耐药基因检测

采用煮沸法提取产ESBLs菌株及对喹诺酮类药物表现出完全或中度抗性的菌株的总DNA制备模板。采用PCR法，进行ESBLs基因(bla TEM、blaSHV、blaCTX、blaOXA)和PMQR基因[qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac(6′)-Ib-c、qepA、oqxA、oqxB]的检测。引物参照文献设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系：模板DNA 2 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、2×Taq聚合酶体系(含染料)10 μL、ddH2O 6 μL，反应体系总体积为20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，根据不同引物设置对应的退火温度，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃彻底延伸10 min；4 ℃保温5 min。引物的核酸序列、终产物长度、退火温度见表2。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 ESBLs 及PMQR 基因扩增相关信息

2 结 果

2.1 耐药性

52株大肠埃希氏菌分离菌株均至少对1种及以上抗菌药物具有耐药性，对红霉素耐药率最高，其次是复方新诺明、四环素、头孢噻肟、阿莫西林—克拉维酸、氯霉素、氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶、链霉素、萘啶酸、氟苯尼考、哌拉西林，对氧氟沙星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星耐药率较低，均对阿米卡星敏感(表3)。

表3 52株大肠埃希氏菌分离株耐药情况

52株菌株分别有46个不同的耐药表型，其中编号为C0211、P0711、P0902、P1101、R0111的菌株只对红霉素耐药，编号为R0612、R1103的菌株对四环素、复方新诺明等4种药物耐药，编号为d14、d18的菌株对头孢吡肟、氨曲南等7种药物耐药，其余43株菌均有不同的耐药表型(表4)。

52株菌株中32株对β-内酰胺类药物耐药，10株确证为产ESBLs菌株，检出率为19.2%(10/52)；检出15株对喹诺酮类药物耐药菌株，检出率为28.9%(15/52)；2株菌株为产ESBLs及喹诺酮类药物耐药菌株，检出率为3.8%(2/52)，均分离自文蛤(表4)。

自新鲜贝类中分离的菌株，对哌拉西林耐药率最高，其次为氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星，对呋喃妥因敏感；而从冷冻水产品中分离的菌株对哌拉西林、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星均敏感，均具有对呋喃妥因的耐药性。可见不同来源的分离菌株对抗菌药物的耐药性有差异(表3)。

76.9%(40/52)的菌株具有多重耐药性(耐药种类3～9类)。其中，来自新鲜贝类的菌株占40%，来自冷冻水产品的菌株占60%；8重以上耐药菌株中冷冻水产品分离菌株占87.5%(7/8)。可见来源于冷冻水产品的分离菌株多重耐药性较来源于新鲜贝类的分离菌株严重(表4)。

2.2 耐药基因检测

10株产ESBLs大肠埃希氏菌分离株中有8株菌株携带1种或2种ESBLs耐药基因，2株菌株未检测出ESBLs耐药基因；15株喹诺酮类耐药大肠埃希氏菌分离株均携带3种或3种以上PMQR基因。blaTEM基因和blaSHV基因检出率分别为80%和70%，未检出blaCTX、blaOXA基因；PMQR基因检出率为：qnrA、aac(6′)-Ib-c及qepA 100%(15/15)，qnrS 60%(9/15)，oqxB 53.3%(8/15)，qnrD 6.7%(1/15)，未检出qnrB、qnrC和oqxA基因。结果表明，blaTEM基因为52株大肠埃希氏菌分离菌株中常见ESBLs基因型，qnrA、aac(6′)-Ib-c及qepA基因为常见PMQR基因型。编号为M1003和M0612的菌株同时携带ESBLs基因和PMQR基因，分别对8种及16种抗菌药物耐药，为6重耐药和9重耐药细菌，表现出较广的耐药谱及多重耐药表型(表4)。

表4 52株分离菌株的耐药表型和耐药基因种类

分离株Isolate来源Source耐药表型Phenotypic resistance耐药基因Resistance geneC0511近江牡蛎TE、ATM* 、SXT、PRL*、E、S、CHL/M0521 2文蛤TE、SXT、PRL*、NA#、E、CHL、SqnrA、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd19冻对虾仁TE、SXT 、AM*C、E、CTX、S、F/d20 2冻对虾仁SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CTX*、SqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA耐药7种 Seven kinds of resistanceC0222近江牡蛎TE、AMC*、E、CHL、CTX*、S/d561冻罗非鱼FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CAZ*、CTX*、S、FblaTEM、blaSHVd12 2冻对虾仁FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CAZ*、CTX*qnrA、aac(6')-Ib-c、qepAd16冻罗非鱼片TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CAZ*、CTX*、S/M06111文蛤CN、TE、FEP*、CIP#、ATM*、SXT、PRL*、CAZ*、CTX*、OFX#、SblaTEM、blaSHVd8冻罗非鱼片ATM*、SXT、TE、FEP*、AMC*、E、CHL、F /耐药8种 Eight kinds of resistanced27 2冻鱿鱼TE、SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CTX*、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd10冻对虾仁TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CHL、CAZ*、CTX*、S/d13 2冻罗非鱼TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、E、CAZ*、CTX*、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd11冻罗非鱼片TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CAZ*、CTX*、S、F/d28 2冻鱿鱼FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、E、CHL、CAZ*、CTX*、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxB耐药9种 Nine kinds of resistanced52冻罗非鱼TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、NA#、CHL、CAZ*、CTX*、S、FqnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qepA、oqxBd15冻面包虾TE、FEP*、ATM*、SXT、AMC*、E、CHL、CAZ*、CTX*、S、F/M06121,2文蛤CHL、LEV#、CAZ*、CTX*、OFX#、SCN、TE、FEP*、CIP#、ATM*、SXT、PRL*、NA#、E、NOR#blaTEM;qnrA、qnrS、aac(6')-Ib-c、qe-pA、oqxB

3 讨 论

3.1 耐药性检测

所有分离菌株均表现出对至少1种药物耐药，76.9%的菌株多重耐药。对红霉素、复方新诺明、四环素、头孢噻肟的耐药率较高。结果与张梦涵等[30]研究得出水产品中大肠埃希氏菌对四环素、复方新诺明、阿莫西林—克拉维酸耐药率高的结果相似。叶蕾[29]研究亦发现，广州市水产养殖品中含有大量的抗四环素、复方新诺明的菌株，而耐红霉素的菌株则相对较少。多重耐药研究结果与107株虾源大肠埃希氏菌中多重耐药菌株比例高达86.7%[41]和湛江东海岛对虾育苗场养殖水体细菌52.1%的菌株呈现多重耐药结果[26]相近，提示本地区水产品中大肠埃希氏菌耐药状况较为普遍，多重耐药较严重。这可能与养殖水体污染以及养殖过程中不规范用药有关。

3.2 ESBLs基因和PMQR基因检测

笔者对25株产ESBLs菌株及PMQR菌株分别进行耐药基因检测，结果发现，ESBLs基因检出率为80%，PMQR基因检出率达100%，进一步证实了水产品源大肠埃希氏菌中存在质粒介导的超广谱β-内酰胺酶耐药及质粒介导的喹诺酮耐药，它们已成为潜在的耐药基因库，必须重视和控制水产品中细菌耐药性的发生和传播。blaTEM基因为52株水产品大肠埃希氏菌分离株常见ESBLs基因型，未检出blaCTX和blaOXA基因，与研究结果——blaCTX基因为淡水克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[41]、鱼源[27]、动物源致病性大肠埃希氏菌[15]主要ESBLs基因型，以及刘五高等[6]的综述结论——肠杆菌科中携带CTX基因的质粒较为常见不同，这可能与地域或来源不同有关。2株产ESBLs菌株未检测到相关耐药基因，提示可能存在其他的本试验未检测的blaESBLs基因(如blaVIM、blaNDM等)。qnrA、aac(6′)-Ib-c及 qepA基因为52株水产品大肠埃希氏菌分离菌株常见PMQR基因型，与国内外专家研究结果[13,27,42-43]相符。95%(20/21)的携带耐药基因的分离菌株具有较广的耐药谱(3～16种)并呈现多重耐药(3～9重)。其中编号M0612的菌株同时携带ESBLs基因和PMQR基因，对16种9大类药物耐药，提示同时携带PMQR基因和ESBLs基因有增加菌株耐药性的可能性，与王彬婷等[15,44]的研究结果相同。后续研究可进行遗传元件的检测以及对ESBLs、PMQR 耐药菌株进行接合转移试验，进一步探讨ESBLs基因与PMQR基因的传播机制。

4 结 论

研究结果表明，湛江地区水产品中大肠埃希氏菌普遍耐药，且耐药谱广。菌株同时携带ESBLs基因和PMQR基因有增加细菌耐药性的可能性。