VGLL4、CD44v6蛋白在胃癌组织中的表达及其与术后生存的相关性

张中超 郭德洋 王耀伟

随着人们饮食结构的改变，胃癌的发生率逐年升高，且多数患者发现时已属晚期，预后较差，死亡率较高[1-2]。研究表明细胞因子在癌细胞早期的发生，进展中发挥着至关重要的作用[3]。细胞粘附分子CD44变异体6(CD44v6)是机体组织中1种分化抗原诱导因子，对癌细胞的分化能力具有调控作用，可加剧癌细胞的异常分裂。转录辅助因子退变样蛋白4(VGLL4)为残留样蛋白家族成员之一，对癌细胞的生长迁移具有明显的抑制作用，研究表明VGLL4蛋白水平在肿瘤组织中的表达明显下降，是1种潜在的抑癌蛋白[4]。因此本研究采用免疫组化法对胃癌组织中CD44v6、VGLL4蛋白的表达水平进行探究，分析两者水平与术后生存的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2010年8月至2014年12月本院病理科确诊胃癌患者手术切除癌组织样本及对应距病灶5 cm以上的癌旁正常组织各94例，其中男性59例，女性35例；年龄32～76岁；肿瘤低分化40例，中高分化54例；按UICC第八版胃癌TNM分期标准进行分期，Ⅰ期12例、Ⅱ期31例、Ⅲ期28例、Ⅳ期23例；肿瘤直径≥5 cm患者52例，<5 cm患者42例。纳入标准：①经病理学或细胞学检查确诊为胃癌患者；②术前未经过放化疗以及免疫治疗者；③所有患者均为原发性胃癌患者；④病史资料完整者。排除标准：①自身免疫及传染疾病患者；②合并其他系统原发癌症患者；③中途退出者。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化方法 兔抗人VGLL4、CD44v6单克隆抗体购自ThermoFisher(中国)公司，将样本脱蜡后，分别滴加兔抗人VGLL4和CD44v6单抗，4 ℃保温过夜，取出放置至常温，滴加二抗，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色，利用苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，用树脂密封玻片，置于显微镜下观察。对照组不使用一抗，改用磷酸缓冲液作对照。

1.2.2 结果判定 VGLL4、CD44v6免疫组化结果由2名以上具有相关经验的医师解读，CD44V6阳性表达主要定位于细胞膜中，呈棕黄色；VGLL4阳性表达主要定位于细胞核，呈棕黄色，利用着色强度和阳性细胞百分比对阳性结果进行综合评价。染色强度评分标准：无色=0、浅色=1、较深=2、深色=3。阳性细胞比例评分标准：阳性细胞所占比例≤10%为0分、>10%～50%为2分、>50%～75%为3分、>75%为4分。利用两种指标乘积作为阳性标准，≥3分为阳性，否则为阴性。

1.2.3 随访 所有患者随访资料均完整无缺失，采用电话或门诊随访5年，第一年每3个月进行一次随访，之后每6个月进行一次随访，对患者肿瘤直径、分化程度等相关指标进行统计。以患者手术期到随访截至日或死亡日之间时间计算患者生存期。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理，计量参数采用“Mean±SD”表示，采用t检验；计数资料以(%)表示，采用χ2检验；生存曲线的绘制采用Kaplan-Meier法，以log-rank检验进行差异性比较，通过多元Logistic回归分析进行多因素生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织及癌旁组织VGLL4、CD44v6表达情况比较

在所有胃癌组织检测样本中，VGLL4表达阳性率为14.89%(14/94)，低于癌旁组织的65.96%(62/94)，差异有统计学意义(χ2=50.887，P<0.05)；CD44v6在胃癌组织中表达阳性率为84.04%(79/94)，高于癌旁组织的20.21%(19/94)，差异有统计学意义(χ2=76.735，P<0.05)。

2.2 VGLL4、CD44v6表达与临床病理因素的关系

在所有94例患者癌组织切片中，VGLL4在浸润程度，淋巴转移情况，以及不同TNM分期中的表达差异有统计学意义(P<0.05)，在年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分化程度中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 VGLL4、CD44v6表达与临床病理因素的关系(例，%)

2.3 VGLL4、CD44v6表达与预后的关系

所有94例患者未出现失访情况，随访94例患者5年存活52例，总生存率为55.32%。VGLL4阳性组5年生存率为85.71%(12/14)，高于阴性组的50.00%(40/80)，差异有统计学意义(χ2=6.205,P<0.05)；CD44v6阳性组5年生存率为50.63%(40/79)，低于阴性组的80.00%(12/15)，差异有统计学意义(χ2=3.973,P<0.05)，见图1、图2。

图1 VGLL4阳性与阴性表达生存曲线

图2 CD44v6阳性与阴性表达生存曲线

2.4 胃癌患者生存期相关单因素分析

对影响胃癌患者生存期的相关单因素分析结果表明，肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期、VGLL4、CD44v6表达情况均与患者5年生存率有关(P<0.05)；年龄、性别、肿瘤直径不是患者5年生存率的影响因素(P>0.05)，见表2。

2.5 影响胃癌患者生存相关多因素Logistic回归分析

以患者5年生存率为应变量，以上述有统计学意义单因素作为自变量进行赋值(VGLL4阳性=0，VGLL4阴性=1；CD44v6阳性=0，CD44v6阴性=1；分化程度中高=0，分化程度低=1；浸润深度T3～T4=0，T1～T2=1；淋巴结转移=0，淋巴结未转移=1；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)。经多元Logistic回归分析表明VGLL4阴性、CD44v6阳性、分化程度中高、浸润深度T3～T4、淋巴结转移、TNM Ⅲ～Ⅳ期为影响患者5年生存率的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响胃癌患者5年生存率相关因素多元Logistic分析

3 讨论

胃癌作为常见恶性肿瘤之一，占全部癌症死亡率的20%以上，不良饮食习惯、细菌感染以及家族遗传等都可能导致胃癌的产生。研究发现长期吸烟男性胃癌发病率明显上升[5]。胃癌不仅造成患者肿瘤相关并发症的产生，对患者生存期亦存在明显降低作用。临床上对胃癌的血清观测指标较为单一，主要为糖类抗原125(carbohydrate antigen，CA125)或糖类抗原153(carbohydrate antigen，CA153)等，但研究发现其敏感度较差[6]。

VGLL4作为最近发现的原癌蛋白拮抗因子，为VGLL蛋白家族一员，研究表明对癌细胞增殖具有一定抑制效果，可通过与TEA转录增强因子4(TEA domain transcription factor，TEAD4)结合，竞争性抑制Yes激酶相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)活性[7]。Hippo信号通路为近年来发现的信号通路，对癌细胞增殖具有一定抑制作用，YAP为其下游重要效应分子，正常组织中YAP表达量较低，其Hippo信号通路中某些物质可通过磷酸化调控YAP的表达[8]。机体组织发生病变时，参与调控YAP表达的分子出现异常，造成YAP表达量增加，结合TEDA1，引起癌细胞的产生[9]。因此，可根据对YAP表达的抑制调控Hippo信号通路进而对癌细胞的增殖进行干预。本研究中VGLL4在癌组织中的表达较癌旁组织降低，可能原因为癌组织Hippo信号通路相关调控因子水平异常，导致YAP水平显著升高，YAP与TEAD4的结合抑制了VGLL4的表达，造成癌组织中VGLL4含量降低，而VGLL4在Ⅲ～Ⅳ分期、浸润程度T3～T4、淋巴结转移的患者中表达相对较低提示其可能参与胃癌的发生发展过程，且可能与胃癌患者的病症严重程存在相关性。

CD44为广泛存在于机体细胞表面的蛋白，在细胞与细胞间，细胞与胞质间的物质交流中发挥重要作用，可促进癌细胞进入机体体液循环进而加速癌细胞的扩散[10]。CD44v6为CD44蛋白的变异类型，在正常机体组织以及癌变组织中均有表达但差异明显[11]。研究表明，CD44v6能够通过对癌细胞内NF-KB信号通路的激活作用加速癌细胞的增殖复制，促进恶性肿瘤的早期产生[12]。此外，CD44v6还可通过对癌细胞上皮和间质之间转换效率的提升，加速癌细胞的浸润能力以及转移能力[13]。本研究中CD44v6在癌组织中的表达率明显高于癌旁组织(P<0.05)，提示其阳性表达与胃癌的病情进展存在一定关系，分析原因可能为CD44v6表达量的提高可增强癌细胞的复制能力，使癌细胞能够快速扩增。本试验中所显示的CD44v6表达在不同浸润深度、淋巴转移情况、不同TNM分期上的不同提示CD44v6与癌细胞的转移以及浸润能力存在一定的关系，可能原因为CD44v6的大量表达对胃黏膜的浸润和粘附能力有明显促进作用，导致癌细胞浸润深度增加，对淋巴组织的黏附能力增强，促进了淋巴结转移，从而造成临床分期的提高。

段军等[14]在微小RNA-22(microRNA-22，miR-22)、VGLL4在胃癌组织中的表达及意义中的研究中发现，VGLL4高表达者3年生存率明显低于低表达者，本研究对VGLL4、CD44v6表达情况与患者5年生存率进行了比较，VGLL4阳性组5年生存率为85.71%，高于阴性组的50%(P<0.05)，结论与上述相似，表明VGLL4的表达情况对患者生存率存在一定影响。本研究还探讨了CD44v6对患者5年生存率的影响，结果发现，CD44v6阳性表达患者5年生存率为50.63%，低于阴性组的80.00%(P<0.05)，与陈勇等[15]研究相比5年生存率相比稍高，造成此种差异的可能原因为试验选取患者胃癌不同分期所占比例不同。

为了进一步了解影响胃癌患者5年生存率的重要原因，本研究对胃癌患者常规因素与患者预后的关系进行分析，结果显示肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期对患者预后存在一定的影响，结论与沈绮雯等[16]相符。研究发现肿瘤分化程度、淋巴转移情况、TNM分期及浸润深度为影响胃癌患者5年生存率的独立危险因素[17]。本研究除了对上述因素进行logstic回归分析外，还对VGLL4、CD44v6的表达与患者预后的关系进行探究，结果表明，VGLL4阴性表达、CD44v6阳性表达亦为影响患者5年生存率的独立危险因素。

综上所述，胃癌患者癌组织中VGLL4表达明显降低、CD44v6表达明显升高，二者表达量与患者病理特征密切相关；VGLL4阴性、CD44v6阳性胃癌患者5年生存率显著降低，其表达水平与患者生存期存在明显相关性。