CapG表达与胃癌患者特征及肿瘤细胞迁移、增殖能力的关系

陈雅宁 朱琼琼 秦建领

胃癌是死亡率最高的癌症之一，患者预后较差，目前尚缺乏特定的诊断指标[1-2]。因此，针对胃癌的发生发展过程急需找寻一些新的标记物，为胃癌的诊断及治疗提供新的靶点，以改善患者生存率[3-4]。巨噬细胞加帽蛋白(CapG)是1种肌动蛋白结合蛋白，其发挥作用的机制是通过给微丝末端加帽来对微丝运动进行控制，从而对细胞形态及功能进行调节，最终影响肿瘤细胞的侵袭与迁移过程[5]。CapG高表达后，其通过作用于肌动蛋白的非肌肉细胞时，控制其运动后，使正常细胞的生理过程发生紊乱，并能调节肿瘤细胞的结构及功能[6-7]。肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白可看作成一组促进肿瘤因子，可指导肿瘤的诊断及治疗[8]。本研究通过免疫组化技术检测了癌组织及癌旁组织CapG的表达情况，并应用CapG转染技术，探究CapG对胃癌细胞迁移能力的影响，以探讨CapG对肿瘤细胞增殖、迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 资料

选取我院收治的病理科收集的手术后胃癌组织标本80例、40例胃癌癌旁组织标本，标本获取时间2016年2月至2018年10月，纳入标准：①胃癌的诊断标准参考2015年NCCN《肿瘤学临床实践指南·胃癌》部分的标准；②患者术前经CT、胃镜取活组织检查及术后病理学证实；③手术获取标本前患者未接受放疗、化疗、靶向疗法等；④研究对象的各项基础资料完整；⑤本研究遵守相关医学伦理学要求，对患者的各项资料保密。排除标准：①资料不全；②未经病理学证实；③术前具有放疗、化疗、靶向疗法史。

胃癌组，年龄43～79岁，平均(62.5±7.2)岁；男性47例、女性33例；肿瘤分化程度：高分化22例、中分化30例、低分化28例；AJCC分期：Ⅰ期15例、Ⅱ期40例、Ⅲ期20例、Ⅳ期5例；肿瘤病灶最大直径≤3.0 cm 45例、肿瘤病灶最大直径>3.0 cm 35例；淋巴结转移阳性43例。癌旁组织，年龄46～75岁，平均(61.3±6.6)岁；男性21例、女性19例。两组患者的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 将采集的癌组织及癌旁组织固定在10%中性福尔马林中，进行常规石蜡切片制作以及常规免疫组织化学染色，常规进行脱蜡、脱水操作，将脱水后的玻片用蒸馏水冲洗以使组织清晰。进行抗原修复，然后将其浸泡在3%H2O2溶液中10 min，以阻断内源性过氧化氢酶活性。再用血清进行封闭；将稀释度为1∶200的一抗孵育组织，置于4 ℃摇床上孵育一夜，一抗孵育后，用PBS洗涤玻片3次，每次5 min，接下来进行二抗孵育，加入辣根过氧化物酶，在37 ℃下孵育半小时，同样用PBS洗涤3次；进行常规染色、脱水、透明，用中性胶密封，在显微镜下观察。免疫组织化学评分由两名病理学家使用双盲方法独立完成。

CapG蛋白阳性在细胞核中表达，阳性表达为黄色，①按染色程度分为：不染色(0分)，仅淡黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕黑(3分)；②根据染色细胞百分比结果：≤10%得分为1分，百分比范围为11%～50%得分2分，比例范围为51%～75%得分3分，比例> 75%得分为4分，染色度与阳性细胞得分乘积<3为负，≥3为阳性[9]。

1.2.2 BGC-823胃癌细胞培养及转染 将表达CapG慢病毒的胃癌细胞系BGC-823接种到六孔板中，细胞密度约为30%。24 h后，添加2 ml含10 mg /l聚乙烯(polybrene)的CapG病毒上清液。48 h后，换液，并在72 h后加入筛选药物嘌呤霉素。连续筛选5天后，在荧光显微镜下观察荧光细胞的比例。

观察细胞形态及状态，确定细胞生长良好时，取一6孔板，于转染前24 h，以每孔2×105的细胞量接种，接种后，将其置于37 ℃， 5%CO2培养箱中进行培养。准备转染操作时，换液，加入稀释后的病毒液，添加6微升聚乙烯(polybrene)于每孔中，这样的目的是提高转染效率，上述操作完成后12 h后来观察细胞的状态。如果与未转染组没有区别，请继续培养。24 h后，取出弃掉病毒液体的旧培养基，然后换液。转染48 h后，在荧光显微镜下观察转染效率，再加入2微克/ ml嘌呤进行筛选并长期使用。转染后，细胞长满6孔板，然后常规传代并冻存。

1.2.3 MTT实验 根据常规传代方法消化并计数每组细胞，然后在96孔培养板(边缘孔中充满无菌PBS)中每孔接种5×105个细胞，每孔含有0.2 ml完全培养基，将培养板移至培养皿中，置于培养箱中培养，每个样品设有5个重复孔，将100微升浓度为0.5%的MTT溶液依次加入到每个孔并培养4 h后，除去上清液，并在此过程中注意不要除去Formazan晶体。向每个孔中添加150微升二甲基亚砜，将其置于摇床上，低速摇动10 min以完全溶解晶体，并在酶联免疫测定中测量每个孔在490 nm处的吸光度。

1.2.4 Western-blot检测 按照BCA试剂盒的操作测量总细胞蛋白的浓度，准备分离凝胶和浓缩凝胶，制备SD聚丙烯酰胺凝胶；按试剂盒说明取蛋白样品及上样缓冲液，1∶1混合后置于100 ℃水浴中高温变性，依次进行电泳及电转操作，将进行完电转后的样品转移至PVDF膜上。转移后用丽春红染色，切下所需的对照蛋白标记物片段，并用5%脱脂奶粉密封1 h；孵育稀释度为1∶1000的一抗，将密封膜置于一抗溶液中，排出气泡，并密封袋口。于4 ℃下孵育过夜。以GAPDH内参，一抗孵育后，用TBST洗涤3次，每次10 min，再孵育二抗，再使用同样的方法进行洗涤；显影过程依据化学发光方法操作指南进行，将试剂盒中的A液和B液等量混合(注意存放在黑暗处)，显影时使其浸润在PVDF膜上，数分钟后可以在凝胶成像仪上进行成像并用相应软件进行分析。

1.2.5 Transwell实验 让细胞脱离血清12～24 h以消除血清的影响，用浓度为0.25%的酶蛋白酶对细胞进行常规消化，消化细胞，细胞消化后加入3倍体积的完全培养基，以1200 r/ min离心5 min，弃去上清液，使细胞悬液重悬于PBS中并反复离心2次，将加入Transwell室中的细胞数控制在1～10×105/ml。将Transwell室放入24孔培养板中，形成上下室。向24孔板中加入800 ml 4%(体积分数)的多聚甲醛，并在室温下固定加热20～30 min，用PBS洗涤两次，然后在室温下用0.1%(体积分数)的结晶紫染色溶液染色30 min，然后用PBS洗涤两次。镜下观察 在倒置显微镜下观察并拍照，计算穿过小室膜的细胞数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁组织中CapG蛋白表达情况

胃癌组织中的CapG蛋白阳性表达率(68.75%)高于癌旁组织的(35.00%)，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 胃癌组织与癌旁组织中CapG蛋白表达情况(例，%)

2.2 胃癌组织CapG蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系

在不同AJCC分期、是否发生淋巴结转移的CapG蛋白阳性表达率组间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 胃癌组织CapG蛋白阳性表达与患者临床病理特征的关系(例，%)

2.3 胃癌细胞CapG沉默组、非沉默组的CapG蛋白表达情况

CapG沉默组CapG蛋白相对表达强度(0.573±0.135)显著低于非沉默组(0.931±0.183)，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

1为非沉默组、2为CapG沉默组

2.4 胃癌细胞CapG沉默组、非沉默组的细胞增殖能力、细胞迁移能力比较

对胃癌细胞培养24 h、48 h，CapG沉默组和非沉默组患者的细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)；Transwell实验检测结果显示，CapG沉默组的细胞穿过小室的细胞数目显著低于非沉默组(P<0.05)，见表3。

表3 细胞增殖能力、细胞迁移能力比较

3 讨论

胃癌的发生和发展机制复杂，是多种因素和多种基因共同作用的结果。其中，异常的细胞生长和增殖参与了胃癌的进程，目前有许多学者开始关注细胞骨架蛋白，细胞骨架蛋白是肿瘤细胞膜的主要成分，在肿瘤的转移和浸润中起关键作用[10-11]。细胞骨架的修饰和重建与细胞的迁移和浸润密切相关，寻找参与细胞骨架形成的靶标可能成为将来抑制肿瘤转移的靶标。

研究发现[12]，CapG蛋白与肿瘤转移有关。当存在Ca2+时，CapG蛋白作为一种作用结合蛋白，可以与Ca2+结合，在F-action延伸末端加帽以防止其延伸，参与肌动纤维重塑，控制细胞凋亡并调节细胞行为。体外和体内研究表明CapG蛋白在肿瘤迁移中起作用，且与淋巴结转移密切相关。也有报道称，核内CapG的量与肿瘤的增殖有关，CapG的量越高，肿瘤的生长越快，但是关于其在胃癌中的作用的研究却很少[13-14]。

大多数研究认为CapG与肿瘤增殖没有明显关系[6]，到目前为止，CapG与肿瘤迁移和增殖之间的关系仍存在争议。不同的肿瘤具有不同的功能，它们的核外作用机制和核内调节机制有待进一步探讨。我们研究了CapG与胃癌细胞BGC823迁移和增殖之间的关系。本研究结果显示：胃癌组织中的CapG蛋白阳性表达率显著较癌旁组织高。分析原因是：CapG与细胞骨架结合并作用后，能够调节细胞的迁移行为。CapG蛋白还可能参与细胞内信号转导过程，例如肌动蛋白的聚合和激活。胃癌发生淋巴结转移的几率较高，本研究发现不同AJCC分期、是否发生淋巴结转移的患者之间CapG蛋白阳性表达率有显著差异，提示CapG可能在肿瘤进展中起基础性作，CapG是1种细胞骨架蛋白，细胞骨架是真核细胞中蛋白质纤维的网络结构，细胞骨架蛋白可以通过某种机制与细胞骨架相互作用形成细胞，导致骨骼系统异常[15]。肿瘤细胞恶化后，肿瘤细胞内的微管结构发生变化，异常的微管结构使癌细胞的增殖能力增强，利于肿瘤发生淋巴结转移，CapG还会增加肌动蛋白小体的水平，CapG通过在肌动蛋白丝的两端添加帽调节肌动蛋白的行为，使核CapG经由核转运受体到达细胞核，促进了肿瘤细胞的转移。

本研究结果显示：CapG沉默组CapG蛋白相对表达强度显著低于非沉默组。表明CapG的表达在胃癌肿瘤的迁移过程中起重要作用。经嘌呤霉素筛选后，获得了稳定且低表达CapG的BGC823细胞，并初步探讨了CapG在胃癌中的作用及其机制。CapG在通过C端F-肌动蛋白和微管结合序列调节骨架重排中起重要作用。研究报道，CapG可能经由Hippo-YAP信号通路发挥调节细胞增殖、凋亡过程，进而在肿瘤发生和发展中发挥作用。

本结果证明CapG在胃癌细胞BGC-823细胞中的过度表达对胃癌的增殖及迁移过程中起到促进作用，本研究结果显示：Transwell实验检测结果显示，CapG沉默组的细胞穿过小室的细胞数目显著低于非沉默组。分析原因是因为：CapG的表达被抑制后，细胞克隆形成减少，增殖能力下降。转染后，嘌呤霉素用于筛选获得稳定的低表达CapG，可以抑制EMT过程的发生，抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，抑制肿瘤细胞的生长并促进胃癌细胞的凋亡。动物实验发现[16]，在裸鼠的皮下荷瘤实验中，发现CapG可以显著抑制沉默后皮下肿瘤的体积和重量，肿瘤抑制信号途径中 Hippo 信号通路中主要蛋白升高，并抑制肿瘤细胞的生长。

目前国内针对CapG蛋白与癌症之间关系的研究相对欠缺，在胃癌中就更少有研究报道，本研究通过一系列研究证明了CapG蛋白与胃癌的发生发展有关，这位胃癌的诊治提供临床参考，并指导了接下来的研究方向。

综上所述，CapG蛋白在胃癌组织中表达上调，可能与胃癌的发生发展有关，同时CapG蛋白高表达可促进胃癌细胞发生迁移。