基于COI 基因的六点天蛾属分类学研究

孙永岭，孙颖慧，王 辰，李 娇，齐周洁，赵 宇，李亚宁

（德州学院，山东德州 253023）

六点天蛾属MarumbaMoore，1882隶属于鳞翅目天蛾科，亲缘关系与舟蛾科较近，体型较大，翅展在75～120 mm.幼虫多以林木、果树叶片为食，也有种类危害农作物及蔬菜、牧草，常造成爆发性灾害，对我国农林业造成严重威胁［1］.六点天蛾属目前世界记录有18种（不包含其亚种，且一种未命名），已发表的基因记录约有193 条，约形成28 个集群，其中来自15 个国家的标本存放在15个机构中，但是尚未发现有关中国种类的基因记述.

DNA条形码（DNA Barcoding）最初由加拿大圭尔夫大学（University of Guelph）的动物学家Hebert 等［2］于2003 年提出，以DNA 序列为基础建立物种识别体系，利用DNA 序列的差异进行种级阶元的分类，并与林奈命名系统一一对应，引起国内外学者的广泛关注，为物种分类鉴定提供了新的研究方法和手段［3］.随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是PCR 技术的日趋完善，越来越多的分子生物学技术应用于物种的鉴定和分类［4］.利用DNA 条形码技术进行物种分类，相比于传统的物种鉴定和分类方法有着快速、准确、可自动化的优点.

COI 基因即线粒体细胞色素C 氧化酶亚基I（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I，COI）是昆虫线粒体基因组中一段约645个碱基长度的片段［5］，具有高度保守序列且具有足够变异位点的特征，故成为昆虫分类和种群研究进化指标的重要检测部分.COI基因作为DNA 条形码的优势不仅在于近缘种之间序列位点信息具有足够差异性，还在于其能够被通用引物广泛扩增［6］.

本研究旨在通过DNA 条形码技术对六点天蛾属进行鉴别并与传统分类学方法进行比较分析，以期找到更加快捷方便的物种鉴定方法.

1 材料与方法

1.1 材料

虚拟实验中六点天蛾属种及其亚种共31 个样本COI 片段序列来自BOLD 数据库（Barcoding of life data），序列编号见表1.实体实验中六点天蛾属于2017 年8 月11 日于山东青岛崂山北九水300 m采得的梨六点天蛾（Marumba gaschkewitschi complacensWalker）样本，常温保存、常规方法干制而成.

表1 六点天蛾属Marumba种及其亚种COI片段序列

1.2 方法

1.2.1虚拟实验

将BOLD 数据库中六点天蛾属中17 种及14 亚种的基因序列进行下载，利用MEGA7.0 软件对其构建NJ树（The NJ tree），计算其遗传距离［7］，分析其种间差异和NJ树解析度的准确性［8］.

1.2.2实体实验

1.2.2.1总基因组的提取

取样品足，剪碎，取少量，提取总DNA.加入15μL缓冲液GA到0.2 mL离心管中，放入样品.加入10μL蛋白酶K溶液，涡旋混匀10 s.56℃孵育3 h，可过夜，使样本充分降解消化.加入25μL缓冲液GA，混匀.再加入50μL 缓冲液GB 和1μLCarrier RNA 储存液，浓度为1μg/μL，涡旋混匀10s.加入50 μL的无水乙醇（96%-100%），如果室温超过25℃，要先将乙醇置冰上预冷［9］.轻轻颠倒混匀样品，室温放置5 min，简短离心以去除管盖内壁的液滴.取上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2 中（吸附柱放入收集管中），12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，弃废液，将吸附柱CR2 放回收集管中.向吸附柱CR2中加入500 μL缓冲液GD，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，弃废液.向吸附柱CR2中加入600 μL漂洗液PW，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中.重复操作.12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CR2 置于室温放置3 min左右.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20～50μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中.

1.2.2.2PCR扩增

COI 基因扩增引物为针对鳞翅目设计的引物，引物序列为（LEPF1：ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG；LEPR1：TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA），引物由北京擎科新业技术有限公司合成可特异地扩增鳞翅目部分线粒体DNA 的COI 基因片段.PCR 反应体系总体积为50μL，其中含有25μL 的2×Es Taq MasterMix（Dye），2μL 的Forward Primer 10μM，2μL 的Reverse Primer 10μM，小于0.5μg 的Template DNA，加入使总体积达到50μL 的ddH2O.扩增COI 基因的反应顺序为：循环前94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55-65℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行25～35个循环，最后72℃终延伸2 min.

1.2.2.3产物纯化及测序

PCR 产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行回收，直接作为测序的模板，测序由诺禾致源生物信息科技有限公司完成.

2 实验数据的处理

采用MEGA 7.0对序列进行分析并构建系统发育树.首先对序列进行多重比对，然后用ML法（最大似然法）［10］构建系统发育树，选择Bootstrap 100次检验各支的置信度.以17种六点天蛾为一组，以31 种及其亚种六点天蛾为一组，分析序列并构建系统发育树.另外还要利用MEGA 7.0，计算不同物种间的遗传距离.

3 结果

4 结论与讨论

我们以Notodonta pacifical与N.manitou为外群，构建17种六点天蛾的NJ进化树.由图1可得知17 种六点天蛾中遗传距离最小的是M.timora与M.juvencus，为0.032，最大为M.gaschkewitschii与M.fenzelii，是0.114.由图2 可以看出M.dyras，M.timora，M.juvencus，M.amboinicus，M.cristata的亲缘关系相近，聚集在一起，构成姐妹群体［11］；M.indicus，M.tigrina，M.quercus三者的亲缘关系相近，聚集在一起，构成另一个姐妹群体；M.saishiuanna，M.nympha两者的亲缘关系相近；M.fenzelii和M.jankowskii的亲缘关系相近，同样聚集在一起成为一个姐妹群体；M.spectabilis，M.gaschkewitschii，M.mackii三者的亲缘关系相近，聚集在一起，也构成一个姐妹群体.再由图1可以得出M.dyras，M.timora，M.juvencus，M.amboinicus，M.saishiuanna五者之间遗传距离最小的是M.timora与M.juvencus，为0.032；M.indicus，M.tigrina，M.quercus三者之间遗传距离最小的是M.indicus与M.tigrina，为0.056；M.saishiuanna，M.nympha两者的遗传距离为0.073；M.fenzelii，M.jankowskii两者的遗传距离为0.051；M.spectabilis，M.gaschkewitschii，M.mackii三者之间遗传距离最小的是M.mackii与M.Spectabilis，为0.070.

图1 17种六点天蛾属种间遗传距离

图2 基于COI基因序列17种六点天蛾NJ进化树（以Notodonta pacifical与N.manitou为外群）

图2中加粗部分为置信度超过90的数据，在统计学中，置信度超过90的数据可信度较高，所以由图2 得出的“M.gaschkewitschii，M.mackii，M.spectabilis三者的亲缘关系相近”与“M.fenzelii，M.jankowskii两者的亲缘关系相近”的结论准确性较高，而其他结论需待进一步实验确定.

从图3NJ进化树上分析，I号5种（M.cristata cristata，M.cristata titan，M.cristata bukaiana，M.cristata borneensis，M.cristata centrosinica）、II 号3 种（M.amboinicus luzoni，M.amboinicus celebensis，M.amboinicus amboinicus）、III 号5 种（M.gaschkewitschi carstanjeni，M.gaschkewitschi gressitti，M.gaschkewitschi echephron，M.gaschkewitschi irata，M.gaschkewitschi complacens），IV 号2 种（M.saishiuana，M.saishiuana formosana）均位于一个分支，有较近的亲缘关系，这与传统分类学上的命名相符.且I 号5 种、III 号5 种和IV 号2 种总分支的置信度较高，所以准确性较高.M.spectabilis spectabilis与M.spectabilis malayana之间，M.dyras dyras与M.dyras javanica之间，从命名关系上看应该有较近的亲缘关系，但与NJ 树不符.M.gaschkewitschii gaschkewitschii与I 号从传统命名关系上看也应有较近的亲缘关系但与数据结果不符.造成以上问题原因可能为基因序列太短，存在误差.同时，同一物种之间存在多种多态性，如单核苷酸多态性（SNP），也容易造成误差.以上问题需待进一步实验研究与讨论确定原因.

图3 基于COI基因序列31种（亚种）六点天蛾NJ进化树（以Notodonta pacifical与N.manitou为外群）

对比图2 和图3 可以看出，图2 中“M.gaschkewitschii，M.mackii，M.spectabilis三者的亲缘关系相近”与“M.fenzelii，M.jankowskii两者的亲缘关系相近”的结论，在图3 中有同样的体现，证明了其准确性.