马勃的化学成分研究进展及其在创面修复中的应用

丁晓桐，汤清涵，王裔惟，闵文，孙旭，尹少平，顾薇，陈军

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029；4.泰州市人民医院手足外科，江苏 泰州 225300)

慢性难愈性创面，是指1个月内无法通过正常有序的修复过程达到解剖和功能完整状态的病理性伤口[1]。慢性难愈性创面的高发病率、高致残率、高致死率和高医疗支出为患者和社会带来沉重负担[2-3]。临床治疗手段主要有手术植皮和皮瓣移植、应用生物制剂、物理疗法等[4]，但存在着治疗周期长、费用昂贵、受医疗条件限制、生物药品易降解失活等问题。外用中药能直接作用于创面发挥“扶正祛邪”的功效，具有简、便、廉、验的优势。中药复方应用广泛，但存在用药剂量大、成分复杂、质量难以控制的问题，单味药多为名贵药材，难以普及。所以临床上急需天然安全、使用便捷、效果显著、价格低廉的外用中药。

马勃Lasiosphaera seu Calvatia属于真菌类中药，2020年版《中国药典》收载的马勃为灰包科真菌脱皮马勃LasiosphaerafenzliiReich.、大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd或紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子实体[5]。马勃的传统功效是治疗恶疮，古代医籍中已有其治疗创面的记载，《名医别录》曰其“味辛平无毒，主治恶疮马疥”[6]。《本草从新》谓其“外用敷诸疮、良(每见用寒凉药敷疮者，虽愈而热毒内攻，变生他病，为害不小，此药辛平而散，甚为稳妥)”[7]。作为《中国药典》中为数不多的可直接外用治疗创伤的中药，马勃凭借用药历史悠久、临床治愈率高、用药操作简单的优势，逐渐成为慢性难愈性创面的治疗新星。然而马勃的化学成分种类繁杂，目前缺少系统性研究，与创面修复相关的药理作用和机制尚不明确，极大限制了马勃在慢性难愈性创面治疗中的应用与开发。本文对近年来国内外有关马勃的化学成分与药理作用研究进行综述，展望其在创面修复治疗的应用前景，以期为马勃在临床创伤治疗领域的开发利用提供理论依据。

1 中药马勃的活性物质基础

马勃化学成分种类及来源详见表1。

1.1 甾体类成分

甾体类化合物是马勃的重要药效成分。麦角甾醇作为真菌类的特征甾醇，是真菌细胞膜的类固醇成分和维生素D的前体物质，具有免疫调节、抑菌、抗炎和抗氧化作用。相聪坤等[8]通过高效液相色谱法测定不同品种马勃中麦角甾醇含量为0.010%～0.150%，差异较大。麦角甾酮是药用真菌的主要化学成分之一，广泛存在于大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd等不同品种中，具有抑制超氧阴离子自由基等活性[9]。麦角甾醇过氧化物是具有抗炎、抗氧化活性的小分子次生代谢产物，对金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用，近年来逐渐成为食药用真菌的热点成分之一[10]。研究证明，甾醇类成分β-谷甾醇能显著减少中性粒细胞数量、抑制表皮细胞和巨噬细胞中炎症小体NLRP3的激活；显著减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)而发挥抗炎功效，通过减少羟自由基、超氧阴离子自由基而抑制氧化应激反应；增加抗菌肽的表达、与细菌结合位点结合等方式能有效杀灭病原微生物[11-13]。

1.2 氨基酸

Kivrak[14]通过超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定出大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd总游离氨基酸质量分数为0.200%，必需氨基酸为0.114%，非必需氨基酸为0.086%。马勃来源的必需氨基酸包括色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、组氨酸、蛋氨酸，非必需氨基酸包括酪氨酸、4-羟基脯氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸等。作为止血期所需的营养物质，氨基酸能通过合成细胞外基质促进肌肉愈合[15]。精氨酸通过合成一氧化氮(NO)，改善胶原合成、血液循环和抑制细菌活性;谷氨酸能诱导热休克蛋白表达保护组织免受炎症损伤[16]。研究发现创面局部外用或腹腔注射脯氨酸，能显著促进胶原蛋白合成、再上皮化进程和肉芽组织形成，对伤口愈合有积极作用[17]。

1.3 脂肪酸及酯类

脂肪酸也是马勃的重要组成成分，其中亚油酸、棕榈酸和油酸在脂肪酸中含量最高[18]。生物活性脂肪酸在慢性难愈性创面治疗中发挥关键作用，尤其是不饱和脂肪酸，例如亚油酸、α-亚麻酸和油酸，主要在伤口发挥抗菌、抗氧化、调节炎症的作用。研究证明亚油酸能够在创伤早期加速糖尿病创面的炎症反应进程，亚油酸是花生四烯酸的前体物质，后者能代谢成前列腺素、白三烯等促炎介质，增强局部血管形成、成纤维细胞迁移和分化、细胞外基质的重塑，从而加速伤口愈合[19]。研究证实不饱和脂肪酸能有效调节白细胞趋化性、黏附分子表达、血小板聚集及血管舒张等过程，促进类花生酸受体的表达，在创面促炎和抗炎中发挥平衡作用，其中发挥抗炎作用的潜在机制是改变细胞膜磷脂组成，充当过氧化物酶体增生物激活受体PPAR-γ的激动剂，活化抗炎作用，同时稳定NF-κB/IκB复合物，抑制炎症基因活化[20]。马勃脂肪酸成分中含量最高的油酸、亚油酸属于不饱和脂肪酸，在炎症早期促进炎症介质释放，后期发挥抗炎功效，调节炎症水平，脂肪酸及酯类可能是马勃作用于创面炎症阶段的功效物质。

1.4 多糖

真菌多糖通过增大巨噬细胞体积提高机体免疫、促进巨噬细胞吞噬作用维持内环境稳态、调节巨噬细胞细胞因子分泌量而调节细胞功能，发挥促进创面修复、抗肿瘤、免疫调节、抗溃疡等功能，已被广泛开发成伤口敷料[21-23]。马勃中含量较高的多糖是β-葡聚糖，临床报道证明β-葡聚糖凝胶能有效治疗难愈性创面，β-葡聚糖通过激活创面中巨噬细胞清除坏死组织功能、加快成纤维细胞和角质形成细胞的增殖、促进血管新生，加快创面愈合[24]。有关马勃成分的报道中，多糖研究占比最大，作为含量高且具有活性的成分，马勃多糖在创面修复领域具有极大的研究开发潜力。

1.5 蛋白质及多肽

蛋白质和多肽是马勃主要的水溶性成分，孟晶晶等[18]从脱皮马勃LasiosphaerafenzliiReich.分离得到白色线状环脂肽，高效液相色谱结果显示不同批次含量为0.001%～0.006%。马勃菌素(Calvacin)是一种具有抗肿瘤活性的黏蛋白，主要存在于未成熟马勃中[18]。蛋白质是创面愈合增殖期和重塑期的关键营养物质，主要促进毛细血管形成、成纤维细胞增殖、胶原合成、免疫系统功能提高等，真菌和动物来源的蛋白质及多肽对创面愈合有极大的促进作用[25-26]。已有研究者从马勃中分离出具有活性的蛋白质和多肽，未来应深入研究马勃来源的蛋白质及多肽是否有促进修复期细胞功能等功效。

1.6 挥发性成分

马勃中的挥发性成分从子实体中提取，主要来源于挥发油。不同成熟期子实体的挥发油成分不同，成熟期几乎都是饱和脂肪酸和烷烃类物质，而未成熟期还含有雪松醇、α-石竹烯、氧化石竹烯等倍半萜类物质[27]。雪松醇通过抑制脂多糖诱导的炎症反应，减少TNF-α、IL-1β、环氧合酶-1(COX-1)、环氧合酶-2(COX-2)的mRNA表达，发挥抗炎功效，同时对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用[28]。氧化石竹烯、正辛醇、甲基丁香酚、β-石竹烯、β-谷甾醇等同样具有抑制炎症、抑菌的功效，对创面愈合有一定促进作用[29-32]。

1.7 其他成分

马勃还富含无机元素等，研究者[33]通过电感耦合等离子体质谱法测定脱皮马勃LasiosphaerafenzliiReich.、大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd和紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的无机元素，发现锰(Mn)、铁(Fe)、镁(Mg)、钙(Ca)、钾(K)是马勃的特征无机元素，是马勃生长发育过程中的重要参与者。Ca、Mg、Fe等参与止血凝血、胶原蛋白合成，对难愈性创面愈合有一定辅助作用[34]。

表1 马勃化学成分

(续表一)

(续表二)

(续表三)

2 中药马勃的创面治疗相关药理作用

创面愈合主要包括止血期、炎症期、增殖期和重塑期[44]。止血期通过纤维蛋白和血小板凝聚，触发凝血级联反应，血小板产生的趋化因子会吸引中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等炎性细胞和修复细胞。炎症期几乎与止血期同时发生，包括中性粒细胞招募的早期阶段和巨噬细胞转化的晚期阶段，中性粒细胞和巨噬细胞在该阶段发挥消除细菌生物膜、清除坏死细胞组织、产生大量细胞因子和生长因子以促进增殖期进程的作用。增殖期依靠修复细胞的增殖迁移完成再上皮化、肉芽组织生成和新生组织血管化，重建皮肤屏障，是创面愈合的关键时期。肉芽组织被上皮覆盖后还需要经历长达数月至数年的重塑期方可完成创面的真正愈合。

在创面愈合过程中，众多因素干扰愈合，造成慢性难愈性创面[20]。包括血小板功能异常、新生血管缺失造成血液供应紊乱；单核细胞趋化性和巨噬细胞激活异常，凋亡细胞碎片、中性粒细胞持续累积、促炎介质水平过度，炎症期阻滞；病原微生物在创面定殖，形成生物膜，造成患者免疫缺陷、对抗生素产生耐药性；修复细胞发生增殖和迁移障碍及过度凋亡，细胞外基质产生量过少或被过度破坏而无法形成正常的肉芽组织；同时慢性高血糖破坏神经元传导、引起氧化应激，导致创面难愈。

通过查阅国内外文献，对马勃有关创面修复的药理作用进行总结，主要有止血、抗炎、抑菌、抗氧化反应、降血糖、促成纤维细胞增殖及分泌胶原蛋白等作用，马勃在创面愈合的止血期、炎症期、增殖期和重塑期都能发挥作用，促进创面愈合。

2.1 止血作用

出血是创伤的重大问题，例如战场上由于出血过量导致的死亡率达50%[45]。马勃在传统医学上最常见的用途是作为伤口敷料，产孢组织能够发挥止血作用。杨佳宁等[46]将脱皮马勃LasiosphaerafenzliiReich.不同溶剂提取物给药于小鼠，通过断尾法和毛细管法测定出血时间和凝血时间，结果显示乙酸乙酯和正丁醇萃取物具有显著的止血作用，推测马勃中的无机元素，尤其是凝血因子Ⅳ钙离子激活内源性、外源性凝血系统和血小板，发挥止血作用。由此可见，马勃凭借显著的止血作用在创面修复的第一阶段止血期起效。

2.2 抗炎作用

炎症反应是创面愈合过程中的第二阶段，中性粒细胞和巨噬细胞在早期产生大量促炎介质，当炎症反应过度，炎性细胞、炎症因子无法正常消退或转型时，会延迟创面愈合，所以抗炎作用在创面治疗中非常重要。研究者采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型和小鼠醋酸扭体实验，证明大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd发酵代谢产物具有显著抗炎镇痛作用[47]。复方马勃冲剂(马勃、生大黄、金银花、生地)能有效减少肺炎球菌Ⅰ型标准株静脉感染家兔的血清TNF-α水平，减轻全身炎症反应[48]。由此表明，马勃中的活性成分在创面愈合第二阶段炎症期发挥调控炎症反应的作用。

2.3 抑菌作用

细菌生物膜是诱发慢性伤口的主要因素，细菌释放外毒素引起炎症，促进炎性细胞释放过量蛋白酶和活性氧，有关数据显示，慢性难愈性伤口的活检中有60%发现生物膜，是急性伤口的10倍[44]，慢性难愈性创面中(尤其是糖尿病足溃疡)最常见的细菌包括葡萄球菌、棒状杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和链球菌等[49]。实验证明大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、乙醚提取物、菌丝体提取物、发酵液提取物等对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌等具有不同程度的抑制效果[47]。不同成熟期马勃提取物抑菌效果也不同，未成熟大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd挥发油对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果强于成熟期[27]。由此发现，马勃在创面愈合第二阶段炎症期中发挥抑制病原细菌活性的作用。

2.4 抗氧化作用

创面愈合情况与活性氧有关，活性氧具有杀菌、信号转导、调节炎症反应的作用，但当活性氧产生过量时，会造成蛋白质变性、活细胞丧失功能，加重炎症反应而损害组织[50]。实验证明，大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd菌丝体粗多糖对超氧阴离子自由基(O2-·)和羟基自由基(·OH)具有抑制作用[51]。马勃中含量丰富的酚类化合物、碳水化合物中葡聚糖、黄酮类物质、酚酸和单宁酸的综合作用是导致自由基清除、具有抗氧化活性的原因[18]。由此表明，马勃在创面愈合第二阶段炎症期发挥抑制氧化反应的功效。

2.5 降血糖作用

高血糖环境是糖尿病足溃疡难以愈合的原因之一，持续高血糖状态使机体免疫系统失衡、促进氧化应激损伤血管、抑制生长因子释放、造成周围神经病变[52]。国外团队将大马勃Calvatiagigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd子实体甲醇提取物口服给药于糖尿病大鼠模型进行体内降糖实验，结果显示，90 min后最大剂量400 mg/kg提取物降低血糖水平显著，7 d后200 mg/kg组的降糖水平最为显著，推测β-葡聚糖是促进胰岛素和相关激素形成的活性成分，且降血糖活性成分存在于整个植株中，而不只存在于部分提取物中[53]。由此可见，马勃的降血糖作用能够改善机体环境，缓解慢性创面程度。

2.6 促进成纤维细胞增殖、分泌胶原蛋白

成纤维细胞是创面愈合增殖期的主体修复细胞，发挥分泌胶原蛋白、构建细胞外基质、促进肉芽组织形成等作用。有报道称，在慢性难愈性创面中，尤其是糖尿病皮肤溃疡，创面的愈合延迟甚至不愈主要与成纤维细胞的行为异常相关[54]。所以，能够恢复慢性难愈性创面中成纤维细胞的正常功能，将有效加快创面修复。现代研究报道显示，将马勃粉末制成凡士林油纱布，外敷于大鼠感染创面，观察到肉芽组织形成，成纤维细胞数量相较于空白对照组增加了153%～468%[55]。石毅等[56]发现马勃的乙醇提取物对体外培养的成纤维细胞具有显著的增殖作用，胶原生成量随剂量升高而增多，与空白对照组相比最多可增加274%。由此表明，马勃中活性成分有促进成纤维细胞增殖及胶原合成的功效，对加快创面愈合增殖期进程及修复慢性难愈性创面有积极作用。

创面微环境是指在细胞水平下，细胞间质及成分构成的细胞生存状态，适宜的细胞微环境对细胞的增殖、迁移、分泌、代谢、分化起到维稳的作用[57]。慢性难愈性创面正是由于无法有效控制创面微环境而形成。马勃能够有效抑制细菌生物膜，降低创面的细菌负荷，从而有效控制感染，为创面构建了适宜修复的微生物群。马勃的自由基清除和抗氧化活性能够调节细胞微环境的氧化还原状态，有效控制细胞膜表面的整合素活性、细胞的迁移运动，从而促进创面愈合。在糖尿病创面中，马勃的降血糖功效能避免高血糖引起的糖基化终末产物积累，减少神经组织损伤、炎症反应、氧化应激反应等问题，从而推进成纤维细胞数量增加、胶原蛋白分泌增加，加快创面愈合[58]。综上所述，马勃能通过改善创面微环境，加快增殖期反应进程，发挥创面修复的药理作用。

现代临床中，马勃被广泛用于治疗臁疮、褥疮、压疮、冻疮、湿疹和糖尿病坏疽等各种创面，其中压疮的治愈率可达92.5%[59]，褥疮[60]、臁疮[61]、冻疮[62]等治愈率均可达95%以上，进一步证明马勃在治疗慢性难愈性创面中的优势。马勃治疗慢性难愈性创面的过程见图1。

图1 马勃治疗慢性难愈性创面的过程示意图

3 展望

3.1 马勃的质量控制标准亟待完善

马勃化学成分种类庞杂，经过文献综述现明确6大类成分，分别是甾体类化合物、蛋白质及多肽、氨基酸、脂肪酸及酯、糖类及挥发性成分。目前缺乏针对马勃发挥创面修复作用的有效成分研究，特别是马勃促进增殖期修复细胞增殖、迁移、分泌胶原蛋白功能的有效成分分析。2020年版《中国药典》也并未对马勃的化学成分作出明确规定，针对不同产地、不同品种的马勃应尽快比较其药效成分含量差异，进一步完善马勃药材的质量控制标准。成分研究应结合药效，采用不同极性溶剂对马勃饮片进行提取，将提取物应用于成纤维细胞、角质形成细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等创面修复相关细胞，考察细胞活性，筛选出有效提取物，采用紫外-可见分光光度法(UV-Vis)、气质联用技术(GC-MS)、高效液相色谱串联四级杆/飞行时间质谱技术(HPLC-Q-TOF/MS)等筛选出马勃提取物中含量较高的成分，利用网络药理学、细胞实验和动物实验加以验证。经文献综述推测，若水提物有效，可主要考察马勃蛋白质及多肽、多糖等大分子物质活性，若醇提物有效，可考察脂肪酸、酚类、黄酮种类及药效。

3.2 马勃用于创面修复治疗的药理作用亟待阐明

虽然现代研究表明马勃在创面修复的不同阶段都能发挥促愈功效，但是创面愈合时期相互重叠，逐渐过渡，机制复杂。目前有关马勃在创面治疗中的研究多为临床试验，主要考察患者使用马勃相关制剂的治愈情况。今后应扩大研究马勃在创面治疗中的其他药理活性，观察中药马勃是否能解决慢性难愈性创面的其他关键难题，例如是否能调控中性粒细胞产生的炎症水平，是否能促进巨噬细胞顺利由促炎型M1型转变为抑炎型M2型，是否能平衡基质金属蛋白酶的含量和活性等。同时深入挖掘马勃促进成纤维细胞增殖分泌作用的机制，考察马勃是否能够促进其他修复细胞的增殖迁移行为。

3.3 马勃用于创面修复治疗的剂型亟待优化

临床上马勃的药用形式包括粉末直接外敷[63]、与明胶海绵联用[64]、凡士林油纱布[60]、复方液体制剂[61]等。但是马勃粉末难以储存，易受环境湿度和温度的影响。同时，创面情况也会影响马勃粉末的使用效果，糖尿病足溃疡中湿性坏疽占72.5%～76.6%，少部分属于干性坏疽和混合型坏疽[65]，当创口表面存在少量渗出液，粉末吸附效果较好，而干性伤口较难维持粉末的附着。马勃液体制剂外敷伤口存在皮肤滞留时间短、稳定性差的缺点，马勃粉末与凡士林油纱布联用则容易滋生细菌，所以将马勃与适宜的伤口敷料结合、设计适宜的剂型是未来开发马勃的重要任务。

考虑到马勃的创面治疗作用可能是多成分协同起效，并且传统和现代临床上多应用粉末形式，所以将马勃粉末与现代剂型结合是未来研究的新方向。已有研究者将三七粉末与氨丙基三甲氧基硅烷在水溶液中通过微波处理成功制备出碳硅纳米粒子，该粒子成功保留三七活性，对创面的愈合作用显著[66]。同法可将该技术应用于马勃粉末，在发挥马勃粉末治疗创伤作用的同时规避粉末用药的弊端。研究者通过碳化和氢氧化钾活化工艺将马勃孢子粉作为原料，制备成新型N、C自掺杂空心球多孔碳[67]，未来可与皮肤电子学结合，开发成可穿戴式创面治疗材料。未来应该将新型材料与中药马勃相结合，对传统剂型进行改进，发挥中药多靶点、多层次的功效，创造未来中医药在创面治疗领域的新篇章。

综上所述，中药马勃是一味化学成分众多、药理活性丰富的直接外用治疗创伤的天然药物，具有极高的研究潜力。虽然目前有关马勃治疗创面的报道多为临床用药试验，缺乏明确的药效成分及药理作用机制，但是通过整理分析发现马勃的多种大类成分能在创面修复的各个时期发挥促愈功能，能够有效解决慢性难愈性创面治疗领域缺乏合适外用中药的难题，未来应加大对中药马勃在创面修复方面的研究与开发，将马勃治疗创面的优势发挥到最大。