牙周上皮细胞中CD24与Twist2的表达水平与牙周炎的关系

牛 羚，崔兴萌，徐增利，梁玉伏

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

牙周炎是由多种因素引起的牙齿支持组织的慢性破坏性病变，其发病机制是牙菌斑中的细菌侵犯牙周组织引起的慢性炎症，与微生物、宿主反应密切相关[1].CD24是一种高度糖基化的多肽，与自体反应性T细胞局部保留有关[2].Twist属于高度保守的碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子家族成员，在胚胎发育过程中具有调节细胞迁移的作用，并且可以将上皮细胞转化为间充质细胞[3].作为碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子家族成员，Twist2基因对人牙周膜间充质干细胞的成骨分化具有调节作用[4-5].据报道[6-8]，牙周炎患者血清中含有针对口腔革兰阳性细菌的血清抗体，并且这些抗体可与包括CD24的上皮抗原形成交叉反应，而CD24在反应性牙周上皮和炎性牙龈附属组织中高水平表达.有研究[9-10]表明：Twist2也参与调节炎症因子的表达，但目前对Twist2调控基因的研究有限，Twist2与CD24在牙周炎炎症反应中是否具有相关性，目前尚无相关研究报道.本研究通过模拟牙周炎炎性反应环境，检测CD24与Twist2的表达状况，并初步探讨CD24和Twist2在慢性牙周炎病变的作用.

1 实验方法

1.1 细胞获取与培养

正畸拔除的健康恒磨牙牙根面经过双抗无菌PBS液反复冲洗处理，将冠部在75%酒精中浸泡2 min，在无菌条件下刮取牙根面1/3的牙周膜细胞，置入无菌的PBS 溶液中.将获取的牙周膜组织剪碎，用Ⅰ型胶原酶在 37 ℃水浴中消化20 min，1 000 r/min离心5 min.移除上清液，加入1 mL α-MEM 培养液(含10%胎牛血清、100 μg/mL抗坏血酸、2 mmol/L谷胺酰胺、0.5 μg/mL青-链霉素)，吹匀、接种，置入37 ℃、5 mL/L CO2条件下的恒温孵箱继续培养和传代.

1.2 LPS模拟体外炎性环境

将生长良好的牙周膜上皮细胞以 2×105个/mL 的密度接种到α-MEM 培养液六孔板中，37 ℃、5% CO2的标准条件下进行培养.培养至细胞密度达到80%时去除原培养液，将其随机分成对照组(用α-MEM 培养液培养)、实验1组(用含1 μg/mL LPS的α-MEM 培养液培养)、实验2组(用含1 μg/mL LPS的α-MEM 培养液培养，并加入CD24多肽抗体).实验1组和实验2组细胞继续培养24 h用于后续实验.

1.3 qRT-PCR 检测CD24和Twist2的表达情况

将培养24 h的细胞于无菌环境下去除培养基，加入Trizol试剂将细胞完全裂解，提取总RNA.使用Nano DropRND-1000检测RNA浓度和纯度，用反转录试剂盒合成cDNA，将总RNA进行反转录，按照反转录试剂盒说明书进行操作.反转录产物用qPCR试剂盒(Takara 公司，北京) 进行qRT-PCR 检测，以U6为内参，引物序列(Invitrogen合成)：GAPDH上游5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTG GT-3′(203 bp)，下游5′-GATTTTGGAGGGATCTCG CT-3′；TWIST2 上游5′- GCAAGAAGTCGAGCGAAGAT-3′(96 bp)，下游5′- GCTCTGCAGC TCCTCGA A-3′；CD24上游5′-CCCACGCAGATTTATTCCAG-3′(254 bp)，下游5′-GACTTCCAGACGCCATTTG-3′.

1.4 Western blot 检测Twist2蛋白和CD24表达

应用细胞裂解液裂解牙周韧带细胞，离心收集上清液，再应用BCD法测定蛋白浓度.将样品蛋白质电泳、转膜后用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，与一抗4 ℃反应过夜，PBST洗涤后与二抗在室温下摇床孵育1 h，再次应用PBST进行洗涤.在暗室中红外线下用发光液进行化学发光，经曝光、显影、定影后应用扫描仪扫描胶片，并对目标蛋白质条带进行灰度分析.用内参蛋白质条带光密度值的百分率表示目标蛋白质的相对表达水平，实验重复3次.

1.5 统计学分析

应用SPSS 20.0对实验数据进行处理与统计学分析，选用Graphpad Prism软件作图，实验原始数据行两组独立样本的非参数秩和检验，对于3个样本的计数资料选用方差分析，以P<0.05 为差异具有统计学意义.

2 结 果

将两组牙周细胞应用Trizol法提取总 mRNA，应用qRT-PCR法检测对照组和实验1组中CD24 mRNA、Twist2 mRNA的表达水平，结果显示：对照组和实验1组中CD24 mRNA表达水平分别为1.84±0.25、3.96±0.58；经LPS处理后的炎性环境中CD24 mRNA、Twist2 mRNA的表达量上调，对照组CD24 mRNA表达水平显著低于实验1组，差异具有统计学意义(t=30.02，P<0.05).对照组、实验1组和实验2组中Twist2 mRNA表达水平分别为1.62±0.87、3.64±1.02、0.74±0.29，实验2组中经CD24多肽抗体处理后Twist2 mRNA的表达量降低，低于对照组及实验1组，差异具有统计学意义(F=282.00，P<0.05).见图1.

图1 CD24多肽抗体处理后Twist2 mRNA表达量Fig.1 Expression level of Twist2 mRNA after treatment with CD24 polypeptide antibody

3 讨 论

牙周炎是一种涉及牙周支持组织的慢性传染病，常常导致牙周组织的炎性破坏.在牙周发生病变的过程中，除了牙菌斑及其毒素直接破坏牙周组织外，所产生的免疫反应还会对牙周组织造成严重损害[1].牙周炎患者自身组织核酸可能作为一类多种损伤相关模型分子(damage associated mole- cular pattern molecule，DAMP)，通过牙周局部先天免疫应答的过度激活诱导炎性牙槽骨吸收[11].CD24在健康反应性牙龈的黏附上皮和牙周袋上皮中选择性地高水平表达，且与多种 DAMP有关.CD24对晚期糖基化终产物具有负反馈调节作用，被认为可有效预防牙周组织损伤[12].对有害细菌及其产物的免疫反应引起的上皮附着丧失，被认为是牙周炎破坏性损伤的主要机制.有研究[11]发现：牙周炎患者存在针对口腔革兰阳性细菌的血清抗体，这种抗体可与口腔黏膜上皮抗原(包括CD24)形成交叉反应.CD24自身反应性血清抗体可结合上皮细胞表面的CD24抗原，达到抑制牙周损害的效果.YE P等[9]研究显示：在人类牙周病组织中几乎所有轻度炎症的上皮标本细胞都可与CD24抗体发生反应.GUO W等[13]研究显示：下调CD24 mRNA的表达可降低 E- cadherin表达，并上调Twist、Snail、转化生长因子-β(TGF-β)的表达.

本次研究中，我们通过用含1 μg/mL LPS的α-MEM 培养液培养生长良好的牙周膜上皮细胞，模拟牙周炎的炎性环境，结果发现炎症环境下实验1组较正常培养液培养的对照组细胞中Twist2 mRNA表达水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果说明炎症环境下可以刺激牙龈上皮细胞Twist2 mRNA表达水平.另外，为了研究CD24在牙周炎症中的作用，我们对实验2组牙周膜细胞培养中添加了CD24多肽抗体，观察CD24抗体对牙龈上皮细胞Twist2 mRNA表达水平的影响，结果显示：实验2组牙龈上皮细胞Twist2 mRNA表达水平显著低于实验1组及对照组，提示CD24在调节牙周病牙龈上皮细胞的基因表达中具有重要作用，CD24抗体反应可以负性调节Twist2的表达.其可能的机制是在炎症及免疫细胞及因子的刺激下Twist2表达上调，牙周组织中的成骨细胞受到抑制，而CD24抗体反应又抑制Twist2表达，从而抑制牙槽骨的吸收破坏.但CD24与Twist2在牙周炎中的具体信号传导途径仍需进一步探讨，二者的作用机制有待更深入的探究.