唾液miRNA-144miRNA-21联合检测对食管癌的诊断价值

古佳升， 吴伟东， 刘清峰， 桃卓嫣

食管癌是一种较常见的消化道恶性肿瘤，根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)发布的报告[1]估计，全球每年食管癌新发患者约57.2万例，病死人数约50.9万例，其中有近一半新发病例和超过一半的死亡病例发生在亚洲地区，而中国的食管癌患者人数居全球首位。广州市疾病预防控制中心2020年发布的《2004-2016年广州市食管癌发病趋势分析》[2]表明，相比于城区，郊县和农村地区的食管癌发病率上升趋势明显。治疗食管癌的关键在于早期发现、早期诊断、早期治疗。miRNAs作为一种参与了细胞间信号传递的非编码RNA在细胞信号转导方面发挥着极为重要的作用。miRNA-144是一种新发现的食管癌标志物，但关于其作用机制尚未形成完善的结论。本课题组的前期研究[3]发现，食管癌患者唾液中miRNA-144呈高表达，且特异度高。检测唾液中的miRNA具有成为诊断食管癌新方法的潜力[4]。miRNA-21与多种恶性肿瘤的血管侵袭能力有关，其在恶性肿瘤患者血浆中呈明显高表达，且由于唾液腺有丰富的血供，故其在唾液中也可检出[5-6]。鉴此，本研究旨在分析miRNA-144、miRNA-21在食管癌患者唾液中的表达情况，探讨这两种miRNA基因标志物的联合检测在食管癌早期诊断中的价值及意义。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2015年1月至2019年5月暨南大学附属广州市红十字会医院心胸外科收治的食管癌患者85例(病例组)，均经病理活检与免疫组化检查确诊，其中男37例，女48例，年龄均>60岁。根据美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和国际抗癌联盟(International Union Against Cancer,UICC)分期标准[7]，0期14例，Ⅰ期22例，Ⅱ期11例，Ⅲ期11例，ⅣA期15例，ⅣB期12例。另同期招募本地社区来我院体检的健康志愿者32名作为对照组，其中男18名，女14名，年龄均>60岁。两组排除标准：(1)有高血压、糖尿病及冠心病等慢性病史者；(2)有肝炎、结核及艾滋病等传染性疾病者；(3)有染色体异常等遗传病史者；(4)有其他恶性肿瘤者；(5)标本采集期间有口腔溃疡、口腔恶性肿瘤、牙周炎等口腔相关疾病者。

1.2样本采集 在唾液标本采集之前4 h内，受试者须禁食、禁饮，无抽烟、喝酒行为。棉签蘸取2%的柠檬酸后轻轻擦拭唾液腺开口处，每30 s擦拭1次，待唾液流出时使用无菌负压吸痰器收集唾液，共5次，每次收集约2 ml唾液，共采集10 ml。在完成标本收集工作2 h内，将收集好的唾液置入4 ℃容器中，以3 000 r/min离心15 min以去除细胞沉淀以及食物残渣，-80 ℃保存备用。

1.3唾液miRNA-144、miRNA-21检测 参考既往研究[4]方法，取恒温箱保存的唾液标本置入1.5 ml EP管，采用Trizol法提取总RNA。应用cDNA反转录试剂盒(MBI Fermentas，加拿大)进行反转录，操作严格按照试剂盒说明书进行。应用Bio-Rad CFX96的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪，以获得的cDNA为模板进行PCR扩增(50 μl体系)，miRNA-144、miRNA-21引物序列见表1，并以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PD)作为内参，结果以2-ΔΔCt法进行计算。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以溴化乙锭染色，采用凝胶成像仪进行扫膜成像。

表1 miRNA-144、miRNA-21引物序列

2 结果

2.1两组唾液中miRNA-144、miRNA-21表达水平比较 病例组唾液中miRNA-144、miRNA-21的表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组唾液中miRNA-144、miRNA-21表达水平比较 [M(P25，P75)，相对表达量]

2.2食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21表达水平与病理分期的关联性分析结果 食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21表达水平与病理分期存在关联性(P<0.05)。见表3。在0期～ⅣB期，miRNA-144、miRNA-21表达水平呈上升趋势。Spearman秩相关分析结果显示，miRNA-144和miRNA-21与临床分期呈正相关(rs=0.556，P=0.000；rs=0.575，P=0.000)。

表3 食管癌患者唾液miRNA-144、miRNA-21在各分期中的表达水平比较相对表达量]

2.3唾液中miRNA-144和miRNA-21联合检测在食管癌患者中的诊断价值 以病理活检结果作为金标准，ROC曲线法分析结果显示，唾液中miRNA-144和miRNA-21对食管癌均具有较好的诊断价值，且当联合两指标时，诊断效能进一步提升。见图1，2；表4。

图1 食管癌患者唾液中miRNA-144的ROC曲线图

图2 食管癌患者唾液中miRNA-21的ROC曲线图

表4 唾液中miRNA-144和miRNA-21对食管癌的诊断价值

3 讨论

3.1食管癌是一种比较常见的消化道恶性肿瘤，由于中国人口基数大，全球有近一半的食管癌发生于我国，人数居全球首位[1]。食管癌早期症状不明显，故其早期筛查和诊断主要采用有创伤性方法，包括食管拉网脱落细胞检测技术、消化道内镜技术等[8-9]。这些筛查技术在检查的过程中会给患者造成创伤，且检查费用较高，难以实现较大规模的人群筛查，早期筛查率低。大部分食管癌患者确诊时已属中晚期，失去根治性手术机会[10]。而如果患者能在早期通过准确、有效的检测手段发现病灶，并接受手术切除或免疫治疗等方式，生存率可高达90%[11]。因此，为了实施预防管理和提高食管癌的治疗效果，探寻一种检测精准、便捷且成本低廉的食管癌无创筛查技术和产品，具有重要意义。

3.2唾液是一种唾液腺分泌的弱酸性液体，由于唾液腺血供丰富，唾液中含有广泛的蛋白质、电解质和核酸，且这些物质来源广泛，可反映个体的生理状态[12-15]。miRNAs参与了细胞的生长、分化、凋亡和免疫过程，并在恶性肿瘤的发生、发展中也发挥着重要的作用[13，16-18]。2009年Park等[19]研究发现，口腔癌患者唾液及唾液上清液中至少有50种miRNA呈高表达，且其降解速度慢，稳定性较好。这为以miRNAs为标志物对消化道肿瘤进行早期鉴别提供了思路。

3.3如今，唾液检测作为一种无创性的检测技术，愈来愈多的研究集中于相关标志物的开发，其中包括对远端组织和器官恶性肿瘤的检测[15，18，20]。Setti等[21]通过系统评价的方式验证了唾液中的miRNAs可作为癌症诊断的可靠生物标志物。为了保证实验结果的可靠性，本研究方法参考了最新的唾液分离与定量检测方法[22]。本课题组的既往研究[4]发现，miRNA-144在食管癌患者的唾液及唾液上清液中呈高表达，为进一步研究其在食管癌早期筛查中的应用价值提供了理论依据。而近期也有研究[3]间接验证了miRNA-144是影响食管癌患者预后的一个独立危险因素。另外，有多项研究[6，23]表明，miRNA-21在消化道恶性肿瘤患者的血液中呈高表达，同时也有研究[5，24]显示其在唾液中可以检出。本研究结果显示，与健康者相比，食管癌患者唾液中miRNA-144、miRNA-21的表达水平显著提高，且与患者的病理分期存在关联性，随着肿瘤浸润进展以及远处转移的增加，唾液中两种miRNA的表达水平上升。ROC曲线分析结果显示，miRNA-21和miRNA-144诊断食管癌的ROC曲线下面积分别为0.785、0.777，提示两种标志物均具有较好的诊断价值，且当联合两者检测时，诊断效能进一步提升。

3.4相比于内镜活检等检查，目前唾液检测对于远处肿瘤的诊断价值仍然有限，但其易采集、非侵入的优势值得关注，且患者更易接受，更适宜大规模人群的筛查。本研究针对miRNA-144、miRNA-21的发现可作为未来开发食管癌快速检测试剂盒及仪器的理论基础。但是本研究也存在一些不足之处：(1)研究针对>60岁的健康人群及食管癌确诊患者进行检测，没有纳入良性病变组，这使得研究结论难以在鉴别食管异常增生或溃疡的良恶性方面推广。(2)研究未能在手术后或化疗治疗后随访患者唾液中miRNA-144、miRNA-21表达水平的变化情况，未能评判miRNA-144、miRNA-21对于预测患者预后的价值。在后续的研究中，我们将对此进行完善，以进一步评价miRNA-144、miRNA-21在食管癌患者早期筛查诊断及预后预测中的价值。

综上所述，食管癌患者唾液中miRNA-144、miRNA-21的表达水平呈高表达，其联合检测具有应用于食管癌早期筛查诊断的潜力。