春尺蠖小热激蛋白基因AcinHsp19.4的表达与序列分析*

陈龙 单艳敏 田彦军 崔阔澍

1.河套学院，内蒙古巴彦淖尔

2.内蒙古自治区草原工作站，内蒙古呼和浩特

3.鄂托克草原工作站，内蒙古鄂托克旗

4.四川省农业技术推广总站，四川成都

热激蛋白（heat shock protein，HSP）是一种受外界环境压力刺激可在体内迅速合成且保守性很高的蛋白，在逆境发生时，通过与解析蛋白结合，从而防止蛋白自发折叠而丧失生物活性[1-2]。根据热激蛋白的同源性和分子量可划分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子热激蛋白等家族[3]。小分子热激蛋白的分子量分布较为分散，大小为12～42 kD，具有保守的α-晶体结构域，在序列结构、分子量大小与功能上具有多样性且同源性较低[4-6]。此外，小分子热激蛋白还包括生命必需蛋白[7]。昆虫小分子热激蛋白在饥饿胁迫中也具有重要作用，例如，当利用RNAi技术沉默赤拟谷盗HSP18.3基因时，饥饿组的抗性显著低于对照组[8]。目前，虽然在双翅目、鳞翅目和膜翅目昆虫中发现多种小分子热激蛋白，但是在其它昆虫中却只有很少的小热激蛋白被鉴定出来[9]，更深入的功能研究则更少[10]。因此，开展昆虫小分子热激蛋白的研究有助于全面地了解昆虫小分子热激蛋白的功能。

春尺蠖属鳞翅目、尺蛾科，是一种杂食性害虫，在我国多个省、自治区被列为重点监测对象[11-12]。近年来，春尺蠖危害呈扩大趋势，危害对象由杨、柳、桑、柠条和梨等林木，逐渐扩大至开始危害玉米、小麦等农作物，危害区域从内蒙古、新疆等北方地区逐渐向四川、云南等南部地区迁移。为深入了解热激蛋白与春尺蠖生长发育的关系和在饥饿胁迫中的作用机理，本研究在已有转录组数据中筛选获得1条小分子热激蛋白基因，分析其蛋白理化性质以及在不同时间饥饿处理下的表达谱。

1 材料与方法

1.1 供试材料

春季去乌拉特前旗柠条人工草场采集春尺蠖雌雄成虫带回实验室，以柠条锦鸡儿成对饲喂，待其产卵后，将卵置于人工气候箱中在恒温22℃±1℃，光周期L∶D=18∶6和相对湿度（RH）55%～59%条件下培养，幼虫孵化后，用实验室内种植的柠条锦鸡儿连续饲养，选取4龄幼虫（均为蜕皮后2 d）以备试验。

1.2 研究方法

1.2.1 饥饿胁迫处理方法

对春尺蠖4龄幼虫在不同饥饿处理（6 h、24 h和72 h，以正常饲喂柠条锦鸡儿的春尺蠖4龄幼虫为对照）条件下测定转录组，每个处理3次重复，每个重复10只供试昆虫。

1.2.2春尺蠖AcinHsp19.4基因的获取方法

根据本实验室前期测定的春尺蠖幼虫不同时间饥饿胁迫下转录组数据，以及差异基因表达趋势图及功能注释信息，同时结合BlastP验证，从中筛选出具有完整CDS序列的sHSP基因，命名为AcinHsp19.4（GenBank登录号∶MW336984）。

1.2.3 春尺蠖AcinHsp19.4基因的生物信息学分析

利 用 NCBI ORF Finder （https∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）来预测春尺蠖AcinHsp19.4基因蛋白编码序区。使用在线软件ExPASy-ProtParam tool（http∶//web.expasy.org/protparam/）预测春尺蠖AcinHsp19.4基因编对AcinHsp19.4氨基酸的同源序列的一致性。应用在线预测 工 具 SignalIP5.0 （http∶//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测AcinHsp19.4基因N端信号肽。采用TMHMM 软 件 （http∶//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白跨膜区域进行预测。利用MEGA6.0软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ），同时采用P距离（P-distance）重复运行1 000次重复构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 春尺蠖Acin Hsp19.4基因在饥饿胁迫下的表达分析

从图1中可以看出，AcinHsp19.4基因的表达量呈现上升趋势，在处理0 h（对照CK）、6 h和24 h后，表达量差异不显著，直到处理72 h后，表达量迅速上升且差异显著（P＜0.05）。

2.2 AcinHsp19.4基因蛋白的理化性质分析

春尺蠖Acin Hsp19.4基因蛋白预测分子式为C872H1359N233O261S3，序列全长516 bp，共编码171个氨基酸，蛋白质分子量为19.38 kD，等电点为5.56；半衰期和脂肪指数分别为30 h和78.01，负电荷残基（Asp+Glu）总电荷的27高于正电荷残基（Arg+Lys）总电荷的22；该蛋白的亲水性为-0.560，为疏水性蛋白。不稳定系数为40.33，大于参考值40，故其为不稳定蛋白。该蛋白具有小分子热激蛋白典型的α-晶体结构域。AcinHsp19.4在N端不含信号肽且无跨膜区。

2.3 春尺蠖基因的同源性比对及系统进化关系分析

将春尺蠖AcinHsp19.4基因的氨基酸序列（图2）与NCBI中搜索得到的其它昆虫序列进行比对，分析结果表明，春尺蠖AcinHsp19.4基因氨基酸序列与同为尺蛾科的桦尺蠖一致性最高，达到87.72%，其次为家蚕和斜纹夜蛾，分别达到69.77%和69.71%，而与其它鳞翅目昆虫一致性较低，均低于60.00%，其一致性分别为吊丝虫59.43%，二化螟55.56%，粘虫55.00%，云杉芽卷蛾52.78%。

图 1 AcinHsp19.4在春尺蠖不同时间饥饿处理下的表达谱

图 2 春尺蠖AcinHsp19.4基因的核苷酸及推导的编码氨基酸序列（A）及序列包含的保守结构域（B）

图 3 春尺蠖与其它昆虫sHsp基因的氨基酸序列比对

图 4 春尺蠖与其它昆虫sHSP氨基酸序列构建的系统进化树

通过NCBI搜索其他目昆虫已上传的sHsp的氨基酸序列与春尺蠖AcinHsp19.4序列信息（图3）结合，构建系统进化树。结果显示（图4），进化树中的各鳞翅目昆虫分别聚在不同分支上；在鳞翅目的分支上春尺蠖的sHSP与同为尺蛾科的桦尺蠖的sHSP聚为一类，表明二者亲缘关系最近，其次为夜蛾科的草地贪夜蛾和斜纹夜蛾，与鞘翅目的谷斑皮蠹，直翅目的中华稻蝗亲缘关系逐次变远。

3 讨论

本研究在前期已测春尺蠖4龄幼虫不同时间饥饿处理下的转录组数据库中筛选得到1条小分子热激蛋白基因，经BlastP比对发现其包含小热激蛋白典型的α-晶体结构域，结合同源序列比对与系统进化结果，推测该基因为春尺蠖小分子热激蛋白。小分子热激蛋白具有的典型结构域不仅在分子识别中起到重要作用，而且在分子伴侣功能方面扮演着重要角色，同时是sHSP的典型特征，在分子进化分析的研究中具有重要作用[13，14]。

系统进化结果表明，鳞翅目、鞘翅目和直翅目昆虫分别聚在不同分支上，在鳞翅目分支上春尺蠖Hsp19.4与同为尺蛾科的桦尺蠖Hsp19.4聚为一类，与鞘翅目的谷斑皮蠹，直翅目的中华稻蝗亲缘关系逐次变远；分子量相近或相同的sHSP则分别聚在一支。在棉铃虫中也出现了类似的结果，说明sHSP不仅具有保守性，同时具有种属的特异性[15]。

昆虫在漫长的进化过程中，为了抵御外界不利环境的胁迫，自身进化出很多防御措施，其中热激蛋白表达的调节就是一种手段[16，17]。近年的研究表明，热激蛋白在昆虫应对饥饿胁迫方面发挥着重要作用[18，19]。例如，热激蛋白HSP70在异色瓢虫在饥饿处理8 h后表达量达到峰值[20]。利用RNAi技术沉默赤拟谷盗Hsp18.3基因后，其耐饥饿能力显著下降[8]。在本研究中，AcinHsp19.4在饥饿处理72h后，表达量上调表达，与上述研究结果一致，说明Acin Hsp19.4在春尺蠖应对饥饿胁迫的过程中起到重要作用。

本研究从春尺蠖转录组中鉴定得到AcinHsp19.4蛋白基因，并分析了分子特征和蛋白的理化性质，同时分析了其在不同时间饥饿胁迫处理下的表达情况，为下一步探究春尺蠖热激蛋白与生长发育的关系，以及在饥饿胁迫下的作用机理奠定基础。