结核感染T细胞检测、卡介菌纯蛋白衍生物、结核菌素纯蛋白衍生物在儿童结核诊断中的应用

范锡同，闫思涵

(新乡市结核病防治所 门诊住院部，河南 新乡 453000)

结核(tuberculosis，TB)系人体体抗力下降时，结核分支杆菌入侵所致的一类慢性、具有传染性的疾病，该病的预防和诊治乃全球公共卫生问题[1-2]。由于结核菌可侵犯机体全身不同器官，其中80%以上为肺部感染[3]，若发现为肺结核则可能需要借助影像检查来鉴别结核与其他肺部病变[4]，TB患者确诊后尽早进行干预可确保治疗彻底，因此，对于该类患者早期进行准确诊断十分关键。目前，在TB患者中采取的检查主要包括X线检查、涂片、结核感染T细胞酶联免疫斑点法(T-ELISPOT.tuberculosis，T-SPOT.TB)、卡介菌纯蛋白衍生物(purified protein derivative of BCG，BCG-PPD)及结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，TB-PPD)等多种方式[5]。本研究选取90例疑似结核儿童为研究对象，探讨T-SPOT.TB、BCG-PPD及TB-PPD在儿童TB病变中的诊断效能，期望为临床诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年4月至2020年4月新乡市结核病防治所检查的90例疑似TB儿童为研究对象，其中男43例，女47例；年龄1个月～14岁，平均(7.23±3.26)岁，<5岁组(33例)和≥5岁组(57例)；临床确诊为TB病变患儿42例，非TB患儿48例(肺炎、脑膜炎、淋巴结炎、结肠炎等疾病患儿)。本研究经新乡市结核病防治所医学伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。

1.2 选取标准(1)纳入标准：①持续发热及咳嗽2周以上；②应用抗菌药物后临床症状无缓解；③与活动性肺结核患者一同生活；④经T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD检测。(2)排除标准：①严重器官功能障碍；②检查禁忌；③合并基础性疾病；④合并其他恶性肿瘤；⑤病例资料不全。

1.3 诊断方法

1.3.1T-SPOT.TB检测 采用英国Oxford Immunotec公司所产的试剂盒检测，所有操作过程均依照说明书严格执行。采集2 mL被检儿童外周血，以Ficoll Paque法提出单个核细胞(PBMC)，将PBMC用AIM-V(美德太平洋生物科技股有限公司生产)洗涤2次并稀释成250 000/100 μL的工作液，分别向A、B培养孔加入50 μL A抗原(ESAT6)、B抗原(CFP10)，再将100 μL稀释的工作液加入其中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的环境中培育16～20 h，孵化后用PBS洗涤4次并拍干板孔，然后再在每孔加进50 μL二抗工作液放入4～8 ℃的环境下培育1 h，随后再加入同样剂量的显色液，避光静置5～10 min，干燥2 h显色后观察斑点数。阳性标准：空白对照孔计数≤5，同时A/B孔与之计数之差≥6；空白对照孔斑点计数是6～10，同时A或B孔计数值为其2倍及以上。否则为阴性。

1.3.2BCG-PPD、TB-PPD检测 BCG-PPD检测采用的试剂为成都生物制品研究所有限公司所生产，每瓶1 mL，使用剂量为0.1 mL(50 UI BCG-PPD)，TB-PPD检测所用的试剂是北京祥瑞生物制品有限公司所产，每瓶量及使用剂量均与BCG-PPD相同。两种PPD用法均为在左前臂掌侧中下位置1/3处皮内注入，并在72 h后来院检测入针位置的反应情况，结果均采取硬结横纵径的毫米数为记录标准，反应平均值≥5 mm即为阳性，否则为阴性，若患儿注射后观察到水疱、坏死、淋巴管炎等现象则属于强阳反应，同时对其反应情况做详细注明。

1.3.3诊断标准 (1)2份痰或其他体液标本，经涂片检查，结果显示抗酸杆菌阳性；(2)1份痰或其他体液标本经涂片检查结果显示抗酸杆菌阳性，且具备肺结核胸部影像学特点；(3)1份痰或其他体液标本经涂片检查显示抗酸杆菌阳性，且1份痰或其他体液经分枝杆菌培养为阳性、菌种为结核分枝杆菌复合群；(4)具肺结核胸部影像学特点，且1份痰或其他体液标本检出分枝杆菌核酸结果阳性；(5)病变组织病理学改变符合结合病理学特征。以上5项符合任意一项即可确诊为肺结核。

1.4 观察指标(1)T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD对儿童TB诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值；(2)T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD对以5岁为分界线的患儿TB病变的诊断灵敏度、特异度。

2 结果

2.1 3种检查的诊断效能3种检测方式在儿童TB中的诊断灵敏度比较，差异有统计学意义(χ2=6.533，P=0.038)，两两比较中T-SPOT.TB与BCG-PPD、TB-PPD比较灵敏度更高，差异有统计学意义(χ2=4.200、6.158，P=0.040、0.013)，而BCG-PPD和TB-PPD比较，差异无统计学意义(χ2=0.207，P=0.649)；三者在儿童TB诊断方面的特异度比较，差异有统计学意义(χ2=7.189，P=0.027)，两两比较中T-SPOT.TB比BCG-PPD、TB-PPD有更高的特异度，差异有统计学意义(连续校正χ2=7.207、5.031，P=0.007、0.025)，而BCG-PPD和TB-PPD比较，差异无统计学意义(χ2=0.253，P=0.615)。3种检测方法的检查结果见表1。各种方法诊断儿童TB的阳性预测值比较，差异无统计学意义(χ2=0.073，P=0.964)；诊断儿童TB的阴性预测值比较，差异有统计学意义(χ2=8.076，P=0.018)。两两比较中，T-SPOT.TB阴性预测值高于BCG-PPD、TB-PPD，差异有统计学意义(χ2=4.167、5.042，P=0.041、0.025)；BCG-PPD与TB-PPD比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 3种检查诊断结果分析

表2 3种检查诊断效能分析(%)

2.2 3种检查对<5和≥5岁TB患儿的诊断灵敏度、特异度T-SPOT.TB在≥5岁组儿童结核中的诊断灵敏度为93.10%，高于<5岁组(69.23%)，差异有统计学意义(P<0.05)。3种检测方式诊断<5岁组儿童TB的灵敏度和特异度比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3种检测方式诊断≥5岁组儿童TB的灵敏度和特异度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较中，T-SPOT.TB较BCG-PPD及TB-PPD有更高灵敏度，差异有统计学意义(校正χ2=4.039、4.039，P=0.044、0.044)；T-SPOT.TB的特异度较BCG-PPD、TB-PPD更高，差异有统计学意义(P=0.023、0.023)。见表3、4。

表3 3种检查对<5岁和≥5岁TB患儿的诊断灵敏度比较[%(n/N)]

表4 3种检查对<5岁和≥5岁TB患儿的诊断特异度比较[%(n/N)]

3 讨论

伴随环境的改变以及艾滋病的传播，TB的发病率逐渐增高，多数患者发病过程较缓慢，仅少数患者感染后起病表现较急[6]。由于不同患者结核菌的入侵部位不尽相同，患者的表现也存在相应差别，较多的肺结核患者发病后可无明显症状，随着病变的进展也可伴有发热、乏力、咳嗽等症状[7]；其他部位的结核患者临床表现不一，早期症状较轻或不明显，部分胃部结核者可存在类似胃炎或溃疡等症状，腹部出现疼痛感，肝脏与肠结核者多表现为发热与乏力，还有部分会出现食欲衰减、消化道症状等，因此，临床常常需要根据不同TB患者的病因、表现及实验室检查来作出诊断和评估[8]。对于TB患者而言，在早期检查确诊后应进一步判断其结核类型以及病情进展，明确患者肺部及其他部位的结核活动性，而后遵循尽早采取措施、用药适量、联合治疗、规律用药及全程坚持的原则对TB患者进行干预，以达到最好治疗效果[9]。在儿童这一特殊人群中，TB患儿的最主要表现是低热以及结核中毒，若呼吸系统有症状则可能为病情发展较为严重，由于X线具有一定的电离辐射，对于年龄较小疑似TB的患儿，应尽量减少该方式的检查次数，可在其他检查确诊后采取该技术已确定结核的具体位置、活动及进展等，因此，本研究对T-SPOT.TB、BCG-PPD、TB-PPD 3种诊断方式进行了探讨和分析。

机体感染结核病后，体内会有记忆T细胞生成，若该种细胞后续受到抗原刺激即可被激活，释放出干扰素-γ，T-SPOT.TB则是利用特异性抗原(ESAT6、CFP10)来刺激T细胞，通过酶联显色后再计出斑点数判别被检者有无结核感染。BCG-PPD为卡介菌培养液提取的蛋白质的稀释制剂，TB-PPD为从人型结核杆菌内提出的纯蛋白，可对卡介苗接种对象注射该两种试剂监测其机体免疫反应，也可对疑似TB患者注射该两类试剂观察其皮肤反应以判别出被注射对象体内有无结核杆菌存在。刘珍敏等[10]研究显示，T-SPOT.TB对TB的诊断特异性达到95%以上，对于检测结果为阳性的被检者基本可判断为TB患者，本研究中，90例疑似TB的儿童均接受上述3种检测，T-SPOT.TB的诊断灵敏度、特异度在3种检测方式中均最高，且本研究中T-SPOT.TB对儿童TB的诊断特异度为95.83%，提示T-SPOT.TB与另外两种检测方式比较，有更高的真实性，与上述文献结论有较高的一致性。刘思景等[11]研究指出，T-SPOT.TB对5岁以上TB儿童的诊断有更大的优势，而在5岁以下患儿中的诊断则有不确定性，建议联合其他检测方法进行诊断，以提高幼小儿童TB的诊断准确率。本研究的统计结果中，T-SPOT.TB在≥5岁儿童中诊断TB的灵敏度为93.10%，较<5岁组明显升高，与上述文献观点一致，而与BCG-PPD和TB-PPD两种检测方式比较，也明显更高；T-SPOT.TB对≥5岁儿童TB诊断的灵敏度则可达到100%。这说明该检测方式对≥5岁儿童的诊断更加准确，当≥5岁儿童的检测结果呈阴性时，可排除TB病变情况，可能是年龄较小的幼儿体内淋巴细胞与结核杆菌抗原的反应能力相对更弱，加上其免疫系统不够完善，感染后易转变为活动性TB，但该技术在<5岁组儿童中的诊断特异度也达到90%，也可作为年龄较小的幼儿诊断TB的技术之一。

综上所述，T-SPOT.TB检测在TB患儿中的诊断有较高的应用价值，可作为疑似结核儿童早期就诊速筛查的检测技术，值得临床应用。本研究局限为样本量较少，患儿接受检测后未进行随访，缺少儿童接受不同检测技术时不良反应的发生情况，故今后还需进一步实施大样本量以及不同检测技术在儿童应用中的不良反应发生情况的研究和分析。