雏鸡鸡白痢病原菌的分离鉴定及耐药性检测

杨 兵，喻 芳，李金兆，邓元彬

（1.内江市东兴区石子镇人民政府，四川内江641107；2.内江市东兴区平坦镇农业服务中心，四川内江641107；3.内江市东兴区白合镇农业服务中心，四川内江641107；4.内江市农业科学院，四川内江641000）

雏鸡白痢病是一种由鸡白痢沙门氏菌引起的一种常呈流行性爆发的禽类传染性疾病，对鸡和火鸡的危害极大，其中对2～3周龄雏鸡具有很大危害，以雏鸡急性败血症和表现出白痢为主。本试验在对内江3个鸡场鸡白痢沙门氏菌分离鉴定的基础上，用10种常用抗菌药物对分离株进行了耐药性监测和分析，为临床上合理选择用药、有效防治鸡白痢沙门氏菌病提供科学依据。

1 材料

1.1 病料来源

1.1.1 病例1

龚家镇某鸡场于2020年4月购入雏鸡2000余只，雏鸡饲养6 d后，有2只雏鸡出现死亡；7 d时，部分雏鸡出现精神不振、食欲减退、扎堆等情况，4只雏鸡出现死亡；8 d时，以上现象更加明显，死亡雏鸡数量增至20余只。期初，养殖户认为是由于育雏温度控制不当所致，于是相应增加了育雏房的室温，并添加恩诺沙星、电解多维于2种禽药于雏鸡饮水之中，但是相关症状并未得到缓解，9 d时雏鸡死亡数量已达40余只，10d时死亡雏鸡数量超过100只，遂就诊。经对死亡雏鸡解剖发现，病死雏鸡肝脏和脾脏肿大，有点状出血或灰白色还试点，胆囊较充盈。对采集的样品做药敏试验，采用高敏药甲砜霉素每2 d对雏鸡进行肌肉注射，并用二氟沙星兑水喂食雏鸡，用药后雏鸡死亡率明显降低，5d后所有雏鸡全部恢复正常。

1.1.2 病例2

全安镇某鸡场2020年4月购买雏鸡1400余只，雏鸡饲养第4d，有4只雏鸡突然死亡，其余雏鸡无明显症状，仅有极少部分雏鸡出现了精神不振、食欲减退、扎堆、肛门周边黏附白色粪便等症状，于是就诊。经过剖检发现与病例1极为相识，于是采用病例1的救治方式进行治疗，2 d后病状得到缓解，6 d后所有雏鸡恢复正常。

1.1.3 病例3

银山镇某鸡场2020年5月购买雏鸡1300余只，饲养5d后突然有雏鸡出现死亡，极少部分雏鸡出现与病例1、病例2相似的症状，遂就诊。经剖检发现与案例1、2极其相似，同时采用病例1和病例2的救治方式进行质量，用药2 d后雏鸡停止死亡，持续用药6 d后，全部雏鸡恢复正常。

无菌采集上述3鸡场的发病雏鸡的肝、脾组织，回到实验室对所采取的病料做细菌分离鉴定。

1.2 培养基

SS沙门氏菌鉴别培养基（13 g、加蒸馏水200mL）、普通琼脂培养基（用NaCl 1g、牛肉膏2 g、蛋白胨1 g、琼脂粉1.5 g，加蒸馏水100mL）。分别置于电炉上加热溶解后补足失水、调节pH值为7.3±0.2，将SS沙门氏菌鉴别培养基倒在平皿上，每个平皿15mL制成平板；普通琼脂培养基分别倒在平皿（15mL/个）和试管（3mL/支）制成平板和斜面，将平板和斜面置于115℃高压蒸气灭菌20 min进行高压灭菌[2]。

1.3 革兰氏染色液

第1液：将2.5 g结晶紫融于浓度为95%的酒精（25.0mL）之中，配置成A液；将浓度1%的草酸铵溶液融于蒸馏水之中，配置成B液，将A液与B液混合即可获得第1液[3]。

式中：S与γ分别为每天需要摊铺的面积与每平米洒透层油量[3]。在充分结合工程实际后，令γ取值为0.3L/m3，因此通过上述公式计算可知Qo的值大约为3800L，因而在本工程项目中最终决定使用两台西安达刚生产的DGL5250以及GLS型号的智能沥青洒布车，以有效完成这一施工任务。

第2液：将2 g碘化钾溶300mL的蒸馏水，获得溶液后将1 g碘放入获得的溶液中，并进行稍微的加热溶解，最后对蒸发的蒸馏水进行补足[3]。

第3液：脱色剂可选用浓度为95%的酒精或用70mL浓度为95%的酒精与30mL丙酮制成的混合溶液。

第4液：用浓度为2.5%的番红与10mL浓度为95%的酒精，加90mL蒸馏水配置成花红染色液。

1.4 生化发酵管

本试验主要会用到葡萄糖生化试验管、乳糖生化试验管、麦芽糖生化试验管、甘露醇生化试验管、蔗糖生化试验管、木糖生化试验管、肌醇生化试验管。

1.5 药敏纸片

主要有甲砜霉素药敏纸片、头孢噻呋药敏纸片、卡那霉素药敏纸片、庆大霉素药敏纸片、新霉素药敏纸片、恩诺沙星药敏纸片、环丙沙星药敏纸片、氟哌酸药敏纸片、链霉素药敏纸片和阿米卡星药敏纸片。

1.6 试验动物

5日龄健康小鸡50只，在内江市龚家镇市场上购买。回到实验室饲养观察3d，选用精神良好、采食和饮水都正常的健康小鸡30只用作动物回归试验。

1.7 试验仪器

主要有恒温箱、高压灭菌锅、光学显微镜、电炉、天秤、接种环、烧杯、酒精灯。

2 方法

2.1 细菌的分离培养

2.2 染色与形态观察

2.3 细菌的纯培养

用接种环挑取适量鉴定后的病原菌划线接种在普通的琼脂平板和斜面上，置于37℃恒温培养24 h。

2.4 生化试验

用接种环挑取3株病原菌纯培养物，分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖和肌醇生化反应管中，置于37℃恒温培养24 h后观察糖发酵管内的产气和颜色情况[4]。

2.5 耐药性试验

向纯培养后的带菌斜面注入适量的灭菌蒸馏水，将斜面上的菌落洗下，调整细菌浓度为1×108CFU/mL或1.5×108CFU/mL，相当于0.5麦氏单位，取适量的菌落洗液均匀涂抹在事先准备好的琼脂平板表面，盖上平板于室温中放置数分钟，用无菌小镊子将各种药敏试纸贴于琼脂平板表面，试纸间间隔不少于24 mm，试纸与平板边缘的预留距离不能少于15mm。本次试验采用的琼脂平板直径为90mm，放置药敏试纸数量为4张，在37℃的恒温室中培养了18 h。培养完成后，取出琼脂平板，对药敏试纸周边是否形成抑菌圈进行了细致观察，对于形成了抑菌圈的药敏试纸要测量和收集抑菌圈的直径大小，并按此标准作为指示供试菌株敏感、中度敏感和耐药的依据。其判定标准为：抑菌圈20mm以上为高敏药物，10～20mm为中敏药物，10mm以下为低敏药物[5]。

2.6 动物回归试验

将30只小鸡随机为3个小组，每组10只。取含有菌落的洗液将其滴服给各小组的小鸡：病例1的滴服给第1组的小鸡，病例2的滴服给第2组的小鸡，病例3的滴服给第3组的小鸡，0.5mL/只。不采用任何的抗菌药物对3组小鸡做给药的处理。观察鸡只的发病情况、死亡情况及病理变化。

3 结果

3.1 细菌的分离培养

此次试验，共发现3株沙门氏菌的疑似病例，所有疑似病例直径约为2～3 mm，呈现出圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落。

3.2 染色与形态观察

革兰氏染色镜检，3株细菌均为革兰氏阴性。视野中可见有大量散在排列、单个存在、两端稍圆、形态均一、中等大小的细长杆菌。

3.3 细菌的纯培养

琼脂平板和斜面上均长出大量的细菌其菌落为圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落，直径约2～3 mm不等，平板较斜面更为明显。

3.4 生化试验

试验表明分离出的3株疑似沙门氏菌均符合鸡白痢沙门氏菌菌的特性，具体详情见表1。

表1 生化试验结果Tab.1 Thebiochemical test results

3.5 耐药性试验

试验结果表明，3株细菌均对恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸、链霉素等4种药物低敏或不敏，对其余4种药物中敏或高敏，其中3株病菌均对头孢噻呋高敏[6]，具体情况见表2。

表2 10种药物的抑菌圈直径Tab.2 The diameter of inhibition zoneof 10drugs

3.6 动物回归试验

将分离出的3株沙门氏菌培养物菌落洗液给小鸡滴服后，于第2 d出现精神萎靡、采食下降、拉灰白稀粪等症状，第3 d出现四线，3组试验小鸡分别死亡4只、3只和6只。对死亡小鸡进行解剖后所见症状与前面3个案例症状表现一致，对病变器官进行细菌分离后得到与种菌相同的细菌。

4 讨论

4.1 耐药性的产生

本次试验可以明显的观察到恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸、链霉素产生的很强的耐药性，这些药物都是长期以来常用的治疗沙门氏菌的药物。这4种药物都对革兰氏阴性菌有较强的抑制和杀灭效果。前3种为喹诺酮类药物，对沙门氏菌及肠道细菌引发的疾病有很好的治疗效果，也正是因为上述2类中的4种药物对沙门氏菌的治疗效果明显，导致广大的养殖户在发病的过程中大量的投用，从而使沙门氏菌对其产生了很强的耐药性。

4.2 现有药物的合理使用

近几年，针对鸡白痢，主要使用恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸、链霉素等西药，以上药物虽然在药敏试验中起到了一定的抑菌作用，但是实践效果并不理想，甚至会无效；庆大霉素、卡那霉素等西药药敏试验表现较好，但许多鸡场按照推荐用量用药取得的效果仍不显著。究其原因是因为鸡的消化道对庆大霉素或卡那霉素的吸收消化较少，而鸡白痢属于急性败血性感染，单纯依靠庆大霉素或卡那霉素效果并不显著，而且还会造成防治失败和药物浪费[7]。为此，在鸡白痢病防治中，可以使用中药或者是中西药共同来防治。

4.3 雏鸡白痢发病的因素

雏鸡的生活环境也会直接影响到雏鸡是否会得白痢病，因此，日常养鸡要高度重视养殖场的环境卫生，确保鸡舍干净、通风。对于鸡舍中的各项设施要坚持做到常消毒，进而降低雏鸡发病风险。鸡白痢沙门氏菌病还是典型的垂直传播，因此在鸡场新引进小鸡的时候最好对种鸡场的鸡白痢的发病情况做了解，这样可以减少鸡场的损失。

5 结论

通过试验数据分析表明，3个疑似病例均为雏鸡沙门氏菌感染。本次试验共采用了10种常用的抗菌药物，用于试验3株病原菌均对3种以上的药物产生了耐药性。耐药性的产生主要是由于长期使用同一种常用药物所引起的。本次耐药试验可以明显的观察到恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸、链霉素产生耐药性最为强烈。因此在以后的养殖预防和治疗用药的中应注重不同药物的混合使用，尽量减少长期使用的常用的治疗沙门氏菌的药物的应用。