3 种中药提取物联用对变形链球菌生长的影响＊

王玉帛，杨洁莹

(兰州大学口腔医院,甘肃 兰州 730030)

龋病是一种口腔慢性感染性疾病,主要表现为牙齿硬组织的慢性进行性病损,具有发病率高、分布广的特点。据国家卫生与计划生育委员会发布的第4 次全国口腔健康流行病学调查结果显示,我国5岁和12 岁儿童患龋率分别为70.9%和34.5%,比10年前分别上升了5.8%和7.8%。龋病与多种因素相关,比如饮食、宿主和时间等,但其最主要病因是口腔特定微生物的感染,其中,变形链球菌(Streptococcus mutans,MS)被公认为最主要的致龋微生物,其黏附、聚集于由唾液蛋白所形成的生物膜上,产酸并耐酸,形成酸性微环境从而侵蚀牙釉质造成脱矿进而侵袭牙本质导致龋病的发生[1]。因此,降低致龋细菌数量、减少酸的合成以及阻止菌斑生物膜形成也就成了防治龋病的最为有效的策略。

天然中草药,如厚朴[2]、金银花[3]、甘草[4]等因具有较好的抗菌防龋作用而被广泛报道,但对于多种中草药联用防龋的研究和报道很少。本文以变形链球菌作为致龋菌的代表,对厚朴酚(Magnolol)、木犀草素(Luteolin)、甘草甜素(Glycyrrhizin)及其混合物的防龋能力进行研究。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

厚朴酚(梯系爱酶化成工业发展有限公司,CAS号为528-43-8)；甘草甜素(梯系爱酶化成工业发展有限公司,CAS 号为1405-86-3)；木犀草素(上海源叶生物科技有限公司,CAS 号为491-70-3)；BHI 培养基 (北京索莱宝生物科技有限公司,LA0360-250g)；全波长酶标仪(Infinite M Nano)；变形链球菌(取样于实验室自存菌种)；二甲基亚砜(DMSO)；一次性无菌接种环(上海玉博生物科技有限公司)；ZD-85恒温振荡器(力辰科技)；立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅)；生化培养箱(上海培因实验仪器有限公司)；氯己定漱口水。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备

BHI 培养基(脑心浸液肉汤)制备:将38.5g 脑心浸出液肉汤粉用三蒸水配置成1L 溶液,放入高压蒸汽灭菌锅,在121℃灭菌30min。

1.2.2 菌悬液的制备

在生长着变形链球菌的BHI 固体培养基上用一次性无菌接种环挑取一个单菌落,接种于3mL BHI 液体培养基中,放在ZD-85 37℃恒温振荡器中,复苏48h,分光光度计调定菌悬液浓度为106CFU/mL (A600=0.2)

1.2.3 实验药液的制备

厚朴酚药液制备:将3.2mg 厚朴酚粉加入到20mL 的DMSO 中,配置成160μg/mL 的厚朴酚储备液。用BHI 培养基将厚朴酚储备液浓度等比稀释,最终配置成（μg/mL）：160、80、40、20、10、5、2.5 的溶液,室温储存。

木犀草素药液制备:将20mg 木犀草素粉加入到20mL 的DMSO 中,配置成1mg/mL 的木犀草素储备液。用BHI 培养基将木犀草素储备液浓度等比稀释,最终配置成（μg/mL）：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 的溶液,室温储存。

甘草酸药液制备:将12mg 甘草酸粉加入到20mLDMSO 中,配置成600μg/mL 的甘草酸储备液。用BHI 培养基将甘草酸储备液浓度等比稀释,最终配 置 成（μg/mL）：600、300、150、75、37.5、18.75、9.375 的溶液,室温储存。

以上药液以体积比1:1 混合时,实际浓度为制备药液浓度的一半。

1.3 混合液对变形链球菌生长的影响

1.3.1 微量肉汤稀释法

在96 孔板中,以A 液横向浓度梯度稀释,加满八排,B 液纵向浓度梯度稀释,加满八列,第九列加入阳性对照(氯己定漱口液加菌液),第十列加入阴性对照(培养基加菌液),第十一列加入空白对照(液体培养基),前十列均加入变形链球菌,第十一列仅加入液体培养基的方法,将三种药液两两混合物制板,其中每种药液体积均为90μl,菌液为20μl。放入ZD-85 恒温振荡器,待变形链球菌达到对数增长期(11h),先肉眼观察,再用全波长酶标仪测定其OD 值三次取平均值,使用Graphpad Prism 8 软件进行Heatmap数据分析,以8 列和H 排的数据,找出三种药液单独使用时的MIC 值。实验做3 次取平均值。

1.3.2 联合药敏实验

在96 孔板中,以A 液横向浓度梯度稀释,加满八排,B 液纵向浓度梯度稀释,加满八列,第九列加入阳性对照(氯己定漱口液加菌液),第十列加入阴性对照(培养基加菌液),第十一列加入空白对照(液体培养基),前十列均加入变形链球菌,第十一列仅加入液体培养基的方法,将三种药液两两混合物制板,其中每种药液体积均为90μl,菌液为20μl。放入ZD-85 恒温振荡器,待变形链球菌达到对数增长期(11h),先肉眼观察,再用全波长酶标仪测定其OD 值三次取平均值,使用Graphpad Prism 8 软件进行Heatmap数据分析,以颜色明显变化的数据作为所需数值。实验做3 次取平均值。

1.3.3 联合用药效果评价

根据单独用药和联合用药的抑菌效果,计算分级抑制浓度(FIC)指数,从而检测两两之间的抗菌作用关系。FIC 指数=MIC(A 组联合)/MIC(A 组单用)+MIC(B 组联合)/MIC(B 组单用)。

当FIC 指数小于0.5 时,两种药为协同作用；当FIC 指数为0.5～1 时,两种药为相加作用；当FIC 指数大于1 且小于2 时,两种药为无关作用；当FIC 指数大于2 时,两种药为拮抗作用。

2 结果

经肉眼观察和Graphpad Prism 8 分析,每个实验的三次平行对照结果均一致,结果如图1～3 所示和见表1～3。

表1 甘草甜素与木犀草素联合的抗菌试验

表2 甘草甜素与厚朴酚联合的抗菌试验

表3 木犀草素与厚朴酚联合的抗菌试验

2.1 Heatmap 分析结果

2.1.1 MIC 的测定

木犀草素、甘草甜素、厚朴酚对变形链球菌的MIC 分别为（μg/mL）：125、75、20。如图1～3 所示。

图1 甘草甜素与木犀草素不同浓度混合液对变形链球菌的生长抑制作用

图2 甘草甜素与厚朴酚不同浓度混合液对变形链球菌的生长抑制作用

图3 木犀草素与厚朴酚不同浓度混合液对变形链球菌的生长抑制作用

2.1.2 FIC 指数计算

由表1～3 可知，通过计算厚朴酚、木犀草素、甘草甜素联合应用的FIC，FIC1=(62.5/125+37.5/75)=1，FIC2=(10/20+37.5/75)=1，FIC3=(62.5/125+10/20)=1，即当各组分的浓度为1/2MIC 时，各组分的浓度缩小2 倍，比单用厚朴酚、木犀草素、甘草甜素时对变形链球菌抑制浓度提高了2 倍。该结果表明厚朴酚、木犀草素、甘草甜素分别联合应用具有良好的相加抗菌作用。

3 讨论

3.1 国内外研究进展

厚朴酚能作用于变形链球菌的生物膜,抑制变形链球菌生物膜中的主要毒力因子ffh、gtf D、pdp的表达水平,通过凝固细菌蛋白、破坏细菌的细胞膜结构,有效抑制变形链球菌生长。其次,厚朴酚能抑制葡萄糖基转移酶活性减少胞外葡聚糖的合成,减缓细菌发酵产酸,降低对牙面的酸蚀破坏程度,从而大量减少变形链球菌的黏附聚集[5]。木犀草素可以破坏细菌细胞壁、细胞膜的结构,引起膜电位发生变化、胞内成分的释放,从而引起营养物质吸收、ATP活性降低等功能性障碍,最终导致菌体死亡[6]。实验证实,在甘草酸作用下,即使培养基的酸度接近中性,变形链球菌的增殖仍受到明显抑制,说明甘草甜素可能同时抑制了变链菌产酸和分裂增殖,提示甘草酸可能对变链菌糖转运过程和/或糖代谢途径有抑制作用[7,8]。同时其对于变形链球菌生物膜的形成也有一定抑制作用[9]。

3.2 不足与展望

本研究表明,厚朴酚、甘草甜素、木犀草素联合用药时对口腔内主要致龋菌变形链球菌具有良好抗菌性能,且有相加效果。但本实验只研究了对口腔主要致龋细菌的抑制作用。后期需在动物模型下进行进一步研究,探究其对口腔主要致龋细菌的抑制机制等,为进一步临床试验提供基础。综上,可将此混合液应用于牙膏、漱口水等口腔清洁产品,发挥其优良性能,在防龋与口腔清洁领域有较好的应用前景。