大叶千斤拔黄酮类成分提取及抗氧化活性研究

王 岩 于 璐 高建伟 林 巍 薄力影

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

大叶千斤拔[Flemingiamacrophylla(Willd.)O.Kuntze]又名千斤力、千金红等[1]，为2015年版中国药典收载的豆科(Leguminosae)千斤拔属(Flemingia)植物的一种[2]，广泛分布于中国热带和亚热带省区[3]。千斤拔根具有诸多的药理作用，常被作为煲汤原料出现在两广地区百姓们日常的餐桌。研究表明，千斤拔属植物中含有黄酮、有机酸和生物碱等多种化学成分[4-6]，其中黄酮类成分是大叶千斤拔主要成分，尤其以异戊二烯基黄酮含量最多[7]。黄酮类化合物具有广泛的生理活性，包括抗氧化、抗菌、保肝、抗炎和降血脂等[8-9]。

对大叶千斤拔黄酮类化合物进行提取，是开发其黄酮类化合物的关键步骤。目前研究者[10-11]主要利用有机溶剂如甲醇或乙醇的水溶液进行提取。提取方式主要包括回流提取[12]、超声波辅助提取[13-14]、微波辅助提取[15]和静态提取[16]等。超声波和微波提取利用不同频率的波，可加速黄酮化合物在溶剂中溶解的速率，但不易实现规模化生产；静态提取效率过低，耗时较长。相比较而言，回流提取工艺既可节省提取溶剂，同时又在加热过程中提高了分子热运动，减少提取时间。因此，试验拟采用乙醇回流提取大叶千斤拔中的总黄酮，以总黄酮含量为评价指标，通过响应面试验优化提取工艺条件，并对总黄酮提取物的抗氧化能力进行评价，以期为大叶千斤拔黄酮化合物的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙醇、硫酸：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；

DPPH：分析纯，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；

ABTS、氯化铜：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

抗坏血酸：分析纯，天津市登峰化学试剂厂；

新亚铜试剂、TPTZ、氯化铁：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

过硫酸钾：分析纯，上海萨恩化学技术有限公司；

乙酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

钼酸铵：分析纯，西陇科学股份有限公司；

磷酸钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

试验水：超纯水；

大叶千斤拔：云南楚雄中药材经销站。

1.2 仪器设备

超声波清洗器：DL-360E型，上海之信仪器有限公司；

电子分析天平：BSA124S型，赛多利斯有限公司；

紫外可见分光光度仪：752型，上海新茂仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 总黄酮提取工艺流程

大叶千斤拔根洗净→烘干(60 ℃)→粉碎→过筛(80目)→乙醇回流提取(70%乙醇，80 ℃)→旋转蒸发→烘箱干燥(50 ℃)→避光保存备用

1.3.2 总黄酮含量测定

(1)标准曲线绘制：以芦丁为标准物质。分别称取0.2 mg/mL 芦丁标准物质配置的溶液，取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL标准芦丁溶液，将其分别置于离心管(10 mL)中，再加入0.3 mL 5% NaNO2后摇匀并静置6 min，再加入AlCl3(0.3 mL，10%)，静置6 min，然后加入4.0 mL 10% NaOH，使用70%的乙醇定容至刻线处，静置15 min，然后在510 nm处测定反应液的吸光值，以吸光值为纵坐标，标准溶液中芦丁的质量浓度为横坐标作标准曲线(见图1)。

(2)样品总黄酮含量测定：取0.5 mL样品溶液于10 mL 离心管中，加入1 mL 5% NaNO2摇匀，静置6 min 后加入1 mL 10% AlCl3，摇匀，静置6 min后加入10 mL 10% NaOH，再用70%乙醇溶液定容到25 mL，摇匀后静置15 min，然后在510 nm处测定反应液的吸光值，空白以乙醇代替提取液。根据芦丁标准曲线的线性方程计算样品溶液中的总黄酮质量浓度。总黄酮含量以芦丁当量表示(μg/mg)。

(1)

式中：

RE——芦丁当量，μg/mg；

50——样品溶液稀释倍数；

C——样品吸光值代入芦丁标准曲线得到的芦丁质量浓度，mg/mL；

V——提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

(1)提取时间：固定料液比(m大叶千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、乙醇体积分数70%、提取温度40 ℃，考察提取时间(20，40，60，80 min)对总黄酮含量的影响。

(2)料液比：固定提取时间40 min、乙醇体积分数70%、提取温度40 ℃，考察料液比[m大叶千斤拔∶V乙醇分别为1∶4，1∶6，1∶8，1∶10(g/mL)]对总黄酮含量的影响。

(3)乙醇体积分数：固定料液比(m大叶千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、提取时间40 min、提取温度40 ℃，考察乙醇体积分数(60%，70%，80%，90%，100%)对总黄酮含量的影响。

(4)提取温度：固定料液比(m大叶千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)、乙醇体积分数70%、提取时间40 min，考察提取温度(20，40，60，80 ℃)对总黄酮含量的影响。

1.3.4 响应面试验优化提取条件 根据单因素试验结果确定响应面试验的因素水平取值，采用Box-Behnken设计，以总黄酮含量为响应值优化大叶千斤拔总黄酮的乙醇回流提取工艺条件。

1.3.5 抗氧化性能测定 将使自由基溶液的初始浓度降低50%的样品质量浓度定义为IC50；而还原力测定和磷钼法测定中，使吸光值达到0.500的样品浓度定义为IC50[17]。

(1)总抗氧化能力：采用磷钼法[17]。

(2)DPPH自由基清除能力：根据Kim等[18]的方法。

(3)ABTS+自由基清除能力：根据Amirouche等[19]的方法。

(4)铜离子还原能力：采用CuPRAC法[20]。

(5)铁离子还原能力：采用FRAP法[21]。

1.3.6 数据分析与处理 所有试验数据均平行测定3次，采用Design-Expert 8.0.6、Statistix 8、Graphpad Prism 7软件分析所得数据。

2 结果与分析

2.1 大叶千斤拔总黄酮提取工艺优化

根据单因素试验结果确定的试验因素水平见表1。

表1 自变量因素编码及水平

利用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计，试验设计与结果如表2所示。

对表2试验数据进行多元回归分析，得到响应值对自变量提取时间、料液比、乙醇体积分数、提取温度的二次多项回归模型方程：

表2 乙醇提取大叶千斤拔总黄酮优化试验设计与结果

(2)

表3 回归模型方差分析†

由图2可知，料液比不变，随乙醇体积分数增加，总黄酮含量呈先升后降趋势。根据相似相溶原理，当乙醇体积分数较低或过高时不利于黄酮类物质游离出来。当乙醇体积分数恒定，随溶剂量的增加总黄酮含量先逐渐增加后趋于稳定。这是由于原料中的黄酮类物质随萃取剂的增多基本被完全提取，因此总黄酮含量增加趋势逐渐变缓。

图2 乙醇体积分数和料液比对总黄酮含量影响的等高线和响应曲面图

由图3可知，当乙醇体积分数恒定，随温度的升高总黄酮含量逐渐增加后下降。这可能是温度达到了乙醇水溶液的沸点，部分溶液挥发成气态降低了提取效果。

图3 乙醇体积分数和提取温度对总黄酮含量影响的等高线和响应曲面图

利用Design-Expert 8.0.6软件解模型方程(2)的逆矩阵，求得总黄酮含量的最大预测值为76.036 μg/mg，其对应的提取工艺组合为提取时间52.148 min，料液比(m大叶千斤拔∶V乙醇)1∶6.027(g/mL)，乙醇体积分数70.4%，提取温度63.56 ℃。为方便验证，取各参数的近似值：提取时间52 min，料液比(m大叶千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)，乙醇体积分数70%，提取温度60 ℃，经3次实验验证，得到总黄酮含量平均值为75.47 μg/mg，相对于预测值，相对误差为0.74%，说明该回归模型优化的工艺组合是有效的。

2.2 大叶千斤拔粗提取物的抗氧化能力

以大叶千斤拔粗提物质量浓度的对数值为横坐标，自由基剩余率为纵坐标，利用Graphpad Prism 7软件绘制自由基清除能力的半数抑制浓度曲线图，如图4所示。以大叶千斤拔粗提物质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制金属离子还原能力的拟合线性图，如图5所示。

由图4可知，随着提取物质量浓度的增加，DPPH自由基和ABTS+自由基清除率逐渐上升。由表4可知，大叶千斤拔黄酮提取物对DPPH自由基和ABTS+自由基的半数抑制浓度(IC50)分别为0.212 3，0.044 9 mg/mL。大叶千斤拔乙醇提取物对DPPH自由基和ABTS+自由基具有较强的清除能力，但与维生素C的清除能力还有一定差距。

图4 大叶千斤拔提取物清除自由基能力

由图5可知，随着提取物质量浓度的增加，还原铜离子和铁离子的能力逐渐增强。由表4可知，大叶千斤拔黄酮提取物对铜离子和铁离子的半数抑制浓度(IC50)分别为0.221 9，0.731 7 mg/mL，对总抗氧化能力的半数抑制浓度(IC50)为0.389 6 mg/mL。大叶千斤拔乙醇提取物对金属离子的还原能力与维生素C的相当。

图5 大叶千斤拔提取物金属离子还原能力与总抗氧化能力

表4 维生素C和大叶千斤拔提取物的抗氧化能力

3 结论

试验采用乙醇为提取溶剂，在单因素试验基础上，通过响应面试验设计方法对大叶千斤拔的总黄酮提取工艺进行优化，得到最佳的提取工艺为提取时间52 min，料液比(m大叶千斤拔∶V乙醇)1∶6(g/mL)，乙醇体积分数70%，提取温度60 ℃，该条件下提取物的总黄酮含量为75.47 μg/mg。对黄酮提取物进行抗氧化活性评价，结果表明大叶千斤拔乙醇提取物对DPPH自由基和ABTS+自由基具有较强的清除能力，但与维生素C的清除能力还有一定差距，而对金属离子的还原能力与维生素C的相当。试验结果揭示了大叶千斤拔黄酮类提取物具有较强的体外抗氧化作用，后续将进一步探究其抗炎、抗菌、抗肿瘤等生物活性。