免疫磁珠-高效液相色谱法测定虎杖中抑制前白蛋白转化酶枯草菌素9成分含量

刘兴艳，涂家洁，朱承华，赵佳菲，张晓芝

（宁波职业技术学院 化学工程学院，浙江宁波 315800）

虎杖为蓼科蓼属植物虎杖的干燥根茎和根。虎杖主要含蒽醌类、黄酮类、芪类及酚类等的化合物，具有多种药理活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、降血脂、抗氧化、改善心血管等。其中黄酮类、二苯乙烯类及蒽醌类具有显著的降脂作用，被认为是虎杖中降脂作用有效组分[1]。

PCSK9是一个脂质调节蛋白。PCSK9是当前最热的降脂靶点之一，在高脂血症、糖尿病及心血管疾病等中有着重要作用。研究发现家族遗传性高胆固醇血症发生的重要原因之一是PCSK9突变基因[2]。同时，在动物实验揭示了PCSK9在调节胆固醇水平上的作用，PCSK9与常染色体显性家族性高胆固醇血症有关的基因。

本文以降脂相关中药虎杖为研究对象，利用PCSK9磁珠亲和结合HPLC技术快速特异检测抑制PCSK9成分，为寻找PCSK9直接作用成分的筛选提供方法参考，同时对虎杖药效物质基础研究有一定推动作用。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

虎杖（宁波中医院门诊部）；Tris-base（Sigma公司）；咪唑（美仑生物）

1.2 设备

高效液相色谱仪（美国 安捷伦）；超声细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限股份有限公司）；凝胶成像（BIO-RAD）；电子天平（德国Sartouris）。

1.3 试剂配制

（1）Wash Buffer：20mmol/L Na3PO4，500mmol/L NaCl，0～40mmol/L Imidazole，pH 7.4。

（2）Elution Buffer：20mmol/L Na3PO4，500mmol/L NaCl、400mmol/L Imidazole，pH 7.4。

（3）100mmol/L PBS：称取2.964g NaH2PO4·2H2O，85g NaCl，30g Na2HPO4·12H2O，双蒸水H2O定容至1L，调pH为 7.4。其他离子强度的PBS溶液按比例稀释即可。

（4）SBC-115076溶液：取适量SBC-115076，以DMSO配成100mmol/L溶液，即得。

2 实验方法

2.1 条件优化

（1）孵育时间考察。PCSK9磁珠于离心管中（加入1mL，PBS重悬，重复操作一次。磁性分离，加入含1μL SBC-115076溶液，PBS溶液 1mL，将离心管放置于旋转混合仪上，室温分别旋转孵育5min、10min、15min及20min，考察不同孵育时间下阳性药的吸附量。分离后弃上清液。加入PBS 500μL，反复颠倒离心管1min使磁珠重悬，磁性分离，保留磁珠，弃上清液。重复清洗一次。每个离心管中加入200μL Elution Buffer，充分混匀磁珠，置于旋转混合仪上旋转洗脱10min。磁性分离，收集洗脱液，第二次洗脱，合并两次的洗脱液。氮吹吹干，加入100μL甲醇超声溶解，滤过，得样品。

对照组是空载磁珠与SBC-115076结合。HPLC检测SBC-115076的吸附量，通过对比确定最适孵育时间。

（2）分别在4 ℃、10 ℃、25 ℃及37 ℃孵育，考察不同温度的影响。

2.2 液相色谱条件

Agilent 1260 HPLC 色谱系统，选择SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5µm）。流动相由0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）组成，梯度洗脱：0～15min，15%～90% B，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。

2.3 数据处理与分析

实验结果采用Mean±SD表示，采用Student-t检验，p＜0.05表示有统计学意义上的差异，p＜0.01表示显著性差异。制图由 Graphpad prism 7 软件进行。

3 结果

3.1 孵育时间对PCSK9抑制剂SBC-115076与磁珠结合的影响

随着时间的延长，结合率逐步提升，并在15min达到最高蛋白载量（图1）。而后，随着时间继续延长，蛋白载量呈降低趋势。在长时间的孵育过程中，蛋白有失活或非特异结合的风险，最终导致蛋白结合率下降。因此选择合适的孵育时间对蛋白结合很重要，本实验选取15min为结合孵育时间。

图1 孵育时间对SBC-115076与磁珠结合的影响

3.2 孵育温度对PCSK9抑制剂SBC-115076与磁珠结合的影响

随着温度的升高，分子热运动加快，有利于分子间的碰撞和相互作用。如图2所示，随着温度的升高，PCSK9抑制剂SBC-115076与磁珠的结合率逐步上升，在25 ℃下孵育时达到最大。而后随着温度的提升，结合率下降。高温在增加分子热运动的同时，亦会促使蛋白构象变化，致使活性丧失。而且过剧的分子热运动，亦会使已结合的PCSK9磁珠再次断裂。因此选择合适的孵育温度对蛋白结合很重要，本实验选取25℃为孵育温度。

图2 孵育温度对SBC-115076与磁珠结合的影响

3.3 样品提取液的优化

提取溶液有甲醇-水系统、乙醇-水系统和乙腈-水系统，比较甲醇、乙醇和乙腈（90%、70%、50%）的提取效果。将虎杖与磁珠孵育考察加标样回收率，当提取稀释液中乙腈含量达到70%时，加标回收率下降到48.09%。为保证抗体不被破坏，选取70%乙醇作为提取液（图3）。

图3 提取液对虎杖样品加标的影响

3.4 辨识虎杖中抑制PCSK9成分

由图4可知，在280nm波长下，图4（a）图与图4（b）比较，保留时间14.4min峰面积明显较高，排除亲和过程中引入的杂质影响，经过质谱鉴定峰为虎杖苷，是潜在PCSK9抑制剂。

图4 PCSK9磁珠垂钓虎杖中亲和成分HPLC对比图谱

3.5 含量测定

3.5.1 分析条件的确定

通过HPLC对待分析样品进行基本分离，综合考虑分离时间及分离效果，最终选择水/乙腈流动相系统，因所需筛选药材较多，本部分未对其具体流动相比例进行逐一优化，选取统一的梯度洗脱系统，分别在203nm、254nm、280nm、320nm 下进行检测，以综合涵盖虎杖中各类成分。因203nm下检测杂质干扰较大，且本实验所选流动相中含有0.1%甲酸，在末端吸收203nm下会导致基线漂移，影响后续分析，故此部分主要比对其他波长下的峰差异，确定亲和成分。

3.5.2 标准曲线、线性范围和检出限

在色谱条件下，对六个不同浓度的标准溶液经行测定，峰的峰面积为纵坐标（Y），相对应的质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，并根据信噪比（S/N）确定检出限和定量限。虎杖苷在线性范围内线性关系良好，回归方程为Y=378.4X-43.2，相关系数为0.999，检出限为23.1μg/kg，定量限为231.5μg/kg。

3.5.3 准确度和精密度

加入低、中、高三个浓度水平的虎杖苷标准溶液，按照优化的磁珠方法进行孵育，结合高效液相色谱法测定虎杖苷含量，每个加标水平平行测定6次，计算3个浓度水平下虎杖苷的加标回收率和相对标准偏差，结果在3个浓度水平下虎杖苷平均回收率为95.78%～102.51%，相对标准偏差1.4%～3.5%，小于5.0 %，说明该方法可靠，精密度良好，符合高效液相色谱法快速测定的要求。

3.5.4 日间精密度考察

连续5d的加标回收率在 101.63%～103.01%，日间精密度在 4.88%～5.72%，重现性良好（表1）。

表1 虎杖磁珠-高效液相色谱的加标回收率和RSD

4 讨论

磁珠亲和法可将靶标固定于磁珠上，进而从混合物中有效地结合并分离相应配体，具有简便快捷、特异性高的优点。运用此方法，已成功筛选出多种靶标的中药特异亲和成分药物在体内可与其靶点结合，改变靶点的相应生理功能，进而达到治疗效果。本研究基于免疫磁珠结合高效液相色谱法分析，建立了一种筛选PCSK9富集含量检测方法。以PCSK9抑制剂SBC-115076为工具药，对其与PCSK9磁珠的结合关键影响因素（孵育温度和孵育时间）进行了优选。最终优选PCSK9磁珠亲和条件为：磁珠与药物共孵育15min，孵育温度25℃。PCSK9调节LDL-C水平受基因位点突变的影响，通过两种方法突变，其一是增强PCSK9上调LDL-C的能力，导致高胆固醇血症的功能获得型突变，第二是降低或取消PCSK9上调LDLC的能力，导致低胆固醇血症的功能缺失型突变[3-4]。诸多中药，如银杏叶、红花、何首乌、怀牛膝、虎杖、泽泻等均表现出较好的降脂作用，多年临床，安全性佳。近年关于中药与PCSK9的相互作用的研究发现中药，单体成分包括虎杖苷[5]、姜黄素[6]、小檗碱[7]和丹参酮IIA[8]等或药用部位都对PCSK9蛋白转录或表达水平有抑制作用。同时，中药或其单体成分在整体水平上亦展现出对血浆中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及PCSK9水平异常的改善作用。中药成分复杂，虎杖药理活性广泛。本研究选择虎杖这一具有降脂活性的常用中药进行PCSK9磁珠亲和选择，结合HPLC含量测定，快速检测出虎杖中抑制PCSK9成分虎杖苷，进一步明确了虎杖苷与PCSK9的亲和作用，为天然产物虎杖苷的创新开发提供了实验基础。