对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗的化感作用

黄钰芳，张恩和，张新慧，王惠珍，王 琦，刘青林，崔佳佳，袁菊丽

(1 甘肃农业大学 农学院,甘肃 兰州 730070； 2 甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；3 宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004)

化感作用(allelopathy)是植物通过不同的途径向周围环境中释放次生代谢产物，从而对其他植物的生长发育产生促进或抑制作用的现象，当释放的化学物质作用于同种或同科植物时，这一现象称之为自毒作用[1]。研究显示，大多数植物都存在自毒作用，而自毒物质则是产生自毒作用的物质基础，是造成作物连作障碍的主要发动者[2]。化感自毒物质可以通过破坏受体植物细胞膜功能、抑制植株体内抗氧化酶活性、降低植物光合作用能力、改变植物激素含量等来影响植物的生长和发育[3-5]。

兰州百合(Liliumdavidiivar.unicolorsalisb)是甘肃省特色优势农产品，也是兰州市七里河区农民的主要经济来源和脱贫致富的支柱产业。兰州百合忌地性极强，种植一茬要歇地3～5年，而经济利益的驱动加之适生范围的狭窄导致兰州百合连作现象加重。目前有关兰州百合自毒作用的研究主要集中在对幼苗生长影响及化感自毒物质的分离等方面。研究结果显示，自毒作用是导致兰州百合连作障碍的重要因素之一[6-8]。陈君良等[9]研究发现，75%～100%(质量分数)的兰州百合根系分泌物能够抑制自身幼苗的生长，且从中分离得到24种不同的化感自毒物质。石雨仟等[10]研究证实，100 mg/mL的兰州百合根系水浸液能抑制兰州百合幼苗的生长。孙鸿强[11]从兰州百合连作土壤中分离鉴定出11种自毒物质，并发现随连作年限的延长，香草酸、邻苯二甲酸、香兰素等自毒物质呈不断累积趋势。但这些自毒物质对兰州百合的自毒效应及作用机制研究却鲜见报道。鉴于此，本研究在前期试验的基础上，研究了对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246两种物质在单施和共施条件下对兰州百合幼苗生长的影响，以探明不同成分对兰州百合的自毒作用及其成分间的互作效应，为进一步探讨兰州百合连作障碍的发生机制提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的外源对照品，均购置于上海达瑞精细化学品有限责任公司。当年收获的兰州百合种球，由兰州市七里河区西果园镇兰州百合种植基地提供。

1.2 试验方法

1.2.1 不同质量浓度溶液的配置 精密称取适量的对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246，用氯仿溶解后定容于250 mL容量瓶，得到质量浓度为5 mg/mL的溶液。试验时用稀释法分别配置0.02，0.2，2和5 mg/mL的溶液，进行兰州百合幼苗的生物活性试验。

1.2.2 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246单施时的自毒效应研究 试验采用发芽盒-培养皿法。用体积分数75%的乙醇擦洗培养皿及发芽盒内壁，待乙醇完全挥干后，于每个培养皿底部垫2层灭菌滤纸，然后将培养皿放入发芽盒，精密量取各处理质量浓度溶液10 mL，倒入培养皿中，待氯仿完全挥干后，选取大小均匀、健康灭菌的兰州百合种球栽种，每皿9颗种球。以氯仿试剂为对照，每处理重复5次。将种植后的发芽盒放入光照培养箱中，25 ℃条件下培养15 d后，测定各项指标。

1.2.3 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的互作效应 在单施试验的基础上，选取对苯二甲酸二辛酯0.2，5 mg/mL和抗氧剂2246 0.2，5 mg/mL进行互作效应试验，用D0.2A0.2、D0.2A5、D5A0.2及D5A5表示，研究2种物质混合液对兰州百合幼苗生长的影响。试验方法同1.2.2节，在精密量取不同质量浓度的对苯二甲酸二辛酯溶液10 mL后，按照试验设计再分别加入相应质量浓度的抗氧剂2246溶液10 mL，待氯仿完全挥干后，种植兰州百合种球，培养15 d后，测定各项指标。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生物指标的测定 将兰州百合鳞茎的幼根、幼苗从种球结合部切下，分别用十万分之一电子天平和直尺测定其鲜质量和长度，取平均值。

化感效应指数(response index，RI)采用Wi-lliamson等[12]的方法计算：

式中：C为对照值，T为处理值。RI>0时表示促进作用，RI<0时表示抑制作用，绝对值的大小代表化感作用强度。

综合化感效应(synthesis effect，SE)指各指标化感效应指数的加和平均值。SE>0时表示促进作用，SE<0时表示抑制作用，绝对值的大小代表综合化感作用强度。

1.3.2 生理指标的测定 兰州百合幼苗过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性分别采用硫代硫酸钠滴定法、愈创木酚法、氮蓝四唑(NBT)光还原法测定[13]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定[13]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[14]。

1.4 数据分析

利用Miscrosoft Excel 2007软件处理原始数据，通过SPSS17.0软件，对数据进行单因子方差分析，采用新复极差法(Duncan’s)进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单施时对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的自毒效应

2.1.1 对兰州百合幼苗生长的影响 表1显示，不同质量浓度的对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗各生长指标的影响存在一定的差异。随对苯二甲酸二辛酯质量浓度的提高，幼苗长和根长持续下降，当质量浓度提高至0.2～5 mg/mL，幼苗长和根长较对照分别显著下降了16.70%～46.38%和25.63%～69.07%(P<0.05)。幼苗和根鲜质量随对苯二甲酸二辛酯质量浓度的提高呈先上升后降低的变化，当质量浓度达到5 mg/mL时，较对照分别下降了50.71%和29.66%，且幼苗鲜质量与对照差异达显著水平(P<0.05)。

由表2可以看出，不同质量浓度的抗氧剂2246 对兰州百合幼苗各生长指标的影响同样存在差别。随抗氧剂2246质量浓度的升高，根长呈现出不断下降的趋势，幼苗长在质量浓度高于0.02 mg/mL时也呈现出逐渐下降的变化，当质量浓度为5 mg/mL时，幼苗长和根长较对照分别下降了3.94%和3.83%，但差异均不显著。在设置质量浓度范围内，兰州百合幼苗和根鲜质量较对照虽有所增加，但差异不显著。

由表1和表2可以看出，不同化合物对兰州百合幼苗的作用方向和作用程度存在一定的差别。当质量浓度为0.02～5 mg/mL时，对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗苗长和根长均表现为抑制作用，且随质量浓度的增加抑制作用持续增强，而对幼苗鲜质量和根鲜质量的化感效应均表现为先促后抑。与之相比，相同质量浓度范围内，抗氧剂2246对兰州百合幼苗和根鲜质量的化感效应均表现为促进作用，对苗长表现出先促后抑作用，而对根长均表现为抑制效应。综合以上分析可以看出，随溶液质量浓度的升高，同一化合物对兰州百合幼苗的各项生长指标具有不同的自毒效应；而相同质量浓度条件下，不同的化合物对兰州百合幼苗的自毒效应也有所不同。

表1 对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗生长的影响Table 1 Effect of dioctyl terephthalate on seedling growth of Lilium davidii var. unicolor salisb

表2 抗氧剂2246对兰州百合幼苗生长的影响Table 2 Effect of antioxidant 2246 on seedling growth of Lilium davidii var. unicolor salisb

就综合化感效应指数而言，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246均表现出先促进后抑制的效应，但不同的是前者在0.2 mg/mL条件下就能抑制兰州百合幼苗的生长，而后者在5 mg/mL时才发挥抑制作用。

2.1.2 对兰州百合幼苗膜脂过氧化作用的影响 由图1可知，不同化合物对兰州百合幼苗叶片膜脂过氧化程度的影响存在差异性。抗氧剂2246随质量浓度的提高，各处理中CAT活性不断升高，但与对照差异均未达显著水平。对苯二甲酸二辛酯在质量浓度为0.02 mg/mL时，兰州百合幼苗CAT活性较对照提高了40.34%，且差异显著(P<0.05)；随着质量浓度的继续升高，CAT活性开始下降，在2～5 mg/mL时，兰州百合幼苗CAT活性分别下降了29.33%和58.34%，与对照差异均达显著水平(P<0.05)，且2个质量浓度间差异也显著(P<0.05)。

由图1可以看出，在设置质量浓度范围内，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246各处理中，兰州百合幼苗POD活性随溶液质量浓度的升高均呈先升高后降低的趋势。当质量浓度为0.02 和0.2 mg/mL时，二者中POD活性较对照分别上升了49.77%，90.87%和41.88%，13.50%，且前者与对照差异显著(P<0.05)；当质量浓度提高至5 mg/mL，二者中POD活性与对照相比分别下降了39.09%和31.50%，且前者较对照差异显著(P<0.05)。

由图1可知，随对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246质量浓度的提高，兰州百合幼苗SOD活性均表现出先升高后降低的变化，但升高和降低的程度有所不同。0.2 mg/mL时，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246处理兰州百合幼苗SOD活性较对照分别显著提高了9.79%和6.41%(P<0.05)；当质量浓度升高至5 mg/mL时，SOD活性均下降，其中对苯二甲酸二辛酯处理较对照显著降低了44.25%(P<0.05)。

综合以上分析可以看出，不同化合物对兰州百合幼苗抗氧化酶活性的影响存在差异性，其中对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗抗氧化酶活性的影响较大，抗氧剂2246的作用较小。这一结果可能是引起兰州百合幼苗生长差异的重要原因之一。

由图1可知，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246处理兰州百合幼苗MDA含量的变化趋势存在差异。随质量浓度的升高，对苯二甲酸二辛酯处理兰州百合幼苗MDA含量呈持续升高变化，而抗氧剂2246呈先降低后升高的趋势。0.02～2 mg/mL时，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246处理MDA含量的变化与对照相比均不显著；而当质量浓度提高至最大值5 mg/mL时，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246处理MDA较对照分别上升了69.09%和37.95%，差异均达显著水平(P<0.05)。由此可见，高质量浓度条件下，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗叶片细胞膜的破坏作用较大，且前者的破坏作用较强，而后者的作用相对较弱。

图柱上标不同小写字母表示同一处理不同质量浓度间差异显著(P<0.05)。下图同Different lowercase letters indicate significant differences among concentrations (P<0.05).The same bellow

2.1.3 对兰州百合幼苗渗透调节物质含量的影响 图2显示，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246作用下，兰州百合幼苗叶片中可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的趋势。质量浓度0.02 mg/mL条件下，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246处理兰州百合幼苗可溶性蛋白含量较对照有所上升，但上升程度均不显著。当质量浓度提高至2 mg/mL时，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246处理可溶性蛋白含量均下降，但抗氧剂2246处理可溶性蛋白含量仍高于对照，而对苯二甲酸二辛酯处理可溶性蛋白含量较对照显著下降了17.86%(P<0.05)；当质量浓度继续升高至5 mg/mL时，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246中可溶性蛋白含量较对照分别降低了36.60%和15.84%，差异均达显著水平(P<0.05)，且该浓度条件下对苯二甲酸二辛酯中可溶性蛋白含量与2 mg/mL相比，差异也显著(P<0.05)。可见，随质量浓度的提高，对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗叶片中可溶性蛋白含量的影响较抗氧剂2246大。

图2 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effect of dioctyl terephthalate and antioxidant 2246 on soluble protein content of Lilium davidii var. unicolor salisb seedlings

2.2 共施时对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的互作效应

2.2.1 对兰州百合幼苗生长的影响 由表3可以看出，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的4种混合液D0.2A0.2、D0.2A5、D5A0.2及D5A5中兰州百合幼苗长和根长与对照相比均有所下降。其中，幼苗长分别下降了5.55%，4.28%，0.88%和11.49%，根长分别下降了7.60%，5.07%，12.48%和4.09%，但差异均不显著。D5A0.2和D5A5中幼苗鲜质量和根鲜质量较对照也均下降，其中幼苗鲜质量分别降低了1.65%和2.12%，根鲜质量分别降低了5.63%和2.11%，但差异均不显著。

由表3还可知，对苯二甲酸二辛酯(D)和抗氧剂2246(A)交叉试验中，各混合液对兰州百合幼苗苗长、幼苗鲜质量、根长及根鲜质量的作用方向和作用程度有所不同，且与两成分单独的作用效应也有一定差别。结合表1和表2分析可知，D0.2和D5、A0.2和A5对幼苗苗长和根长均表现出抑制作用，而在固定D0.2和D5的基础上，分别加入A0.2和A5后，虽然化感效应指数仍然为负值，但其绝对值均小于D0.2和D5的化感效应指数绝对值，说明两成分共存时对幼苗长和根长未表现出抑制作用的协同效应。D0.2对兰州百合幼苗鲜质量和根鲜质量表现出促进作用，在加入相同作用的A0.2和A5后，D0.2A0.2和D0.2A5中化感效应指数均小于单施时二者的效应指数总和，说明两成分共同作用下，未表现出与单施时同方向的协同促进效应。D5对兰州百合幼苗鲜质量和根鲜质量均具有抑制作用，A0.2和A5均具有促进作用，当给D5中分别加入A0.2和A5后，D5A0.2和D5A5对兰州百合幼苗鲜质量和根鲜质量仍表现出一定的抑制效应，但其化感效应指数绝对值较D5中有所下降。可见，对苯二甲酸二辛酯(D)在加入与之作用相反的抗氧剂2246(A)后仍能保持其抑制效应，仅是作用程度有所下降，说明两成分单施作用方向相反时，在交叉试验中表现出二者相反作用的叠加效应。

由表3还可以看出，就综合化感效应指数而言，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液除了表现出上述互作效应外，还维持了对兰州百合幼苗生长的抑制作用。据此分析，这可能是导致质量浓度交叉试验中兰州百合幼苗各生长指标较相应对照有所下降但却未发生显著变化的重要原因。

表3 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液对兰州百合幼苗生长的影响Table 3 Effect of dioctyl terephthalate and antioxidant 2246 mixture on seedlings growth of Lilium davidii var. unicolor salisb

2.2.2 对兰州百合幼苗膜脂过氧化作用的影响 由图3可知，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246 4种混合液处理兰州百合幼苗CAT、POD、SOD活性及MDA含量与对照相比虽有不同程度的升高或降低，但差异均不显著。可见，在对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的质量浓度交叉试验中，兰州百合幼苗叶片的各抗氧化酶活性均未发生明显变化，抗氧化酶系统能够维持正常的活性氧自由基清除功能，从而保证了细胞膜的正常结构和作用。

图3 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液对兰州百合幼苗叶片膜脂过氧化作用的影响Fig.3 Effect of dioctyl terephthalate and antioxidant 2246 on membrane lipid peroxidation in seedlings leaves of Lilium davidii var. unicolor salisb

2.2.3 对兰州百合幼苗渗透调节物质含量的影响 逆境胁迫下通过累积可溶性物质进行渗透调节是植物主要的抗逆机理之一[15]，而植物细胞中渗透调节物质含量的高低与植物的抗逆性大小以及敏感程度有关[16-17]。对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液对兰州百合幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响见图4。

图4 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液对兰州百合幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响Fig.4 Effect of dioctyl terephthalate and antioxidant 2246 on the soluble protein content in seedlings leaves of Lilium davidii var. unicolor salisb

由图4可知，D0.2A0.2、D0.2A5、D5A0.2和D5A5中，兰州百合幼苗叶片可溶性蛋白含量与对照相比均未发生显著变化，这可能也是引起各处理中兰州百合幼苗苗长、苗鲜质量及根长、根鲜质量较相应对照未发生显著变化的原因所在。

3 讨 论

3.1 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗生长的影响

化感自毒作用发生的物质基础是化感自毒物质。化感自毒物质对受体植物的作用强度与其质量浓度密切相关。低质量浓度的化感物质对植物的生长一般表现出促进作用，而高质量浓度的化感物质表现为抑制作用[18]。本研究发现，在0.02～5 mg/mL时，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗的生长均表现出“低促高抑”现象。但不同的是，前者仅在0.02 mg/mL时表现出促进作用，而在0.2～5 mg/mL均表现出抑制作用，且质量浓度越高，抑制作用越强；而后者在质量浓度小于2 mg/mL时表现出综合促进效应，仅对部分生长指标产生抑制作用，在5 mg/mL时才表现出综合抑制效应。可见，在设置质量浓度范围内，对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗生长的抑制作用强，而抗氧剂2246的抑制效应相对较弱。这一结果与陈君良[19]的研究结论相一致，但与部分学者的结论存在差异。如耿广东等[20-23]在研究二苯胺、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸二丁酯以及香草醛对莴苣的化感作用时发现，在0.005～0.015 mol/L时，上述4种成分对莴苣幼苗生长的影响相同，均表现出抑制作用，且质量浓度越高抑制作用越强。造成这一差别的原因可能是：其一，不同结构的自毒物质本身的作用机制存在差异性；其二，自毒物质溶液质量浓度的设置有所不同；其三，研究中的受试对象存在差别。

3.2 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗生理生化特性的影响

植物在正常生长状态下，体内存在的各种抗氧化酶维持着自由基产生和消除的动态平衡。逆境胁迫下，大量活性氧自由基的产生将诱导酶活性的增加，当胁迫程度超过抗氧化酶的调控作用时，酶活性下降[24-25]。本试验中，对苯二甲酸二辛酯对兰州百合幼苗CAT、POD和SOD活性的影响较大，均呈现先升高后降低的趋势，且升高最大值和下降最低值均与对照差异显著(P<0.05)；抗氧剂2246对CAT、POD和SOD活性的影响较小。相应地，在对苯二甲酸二辛酯的胁迫下，大量活性氧自由基的产生引起细胞膜脂过氧化程度的增强，造成了MDA含量增加，蛋白质水解速度提高、合成速度下降，从而引起可溶性蛋白含量的降低，最终影响幼苗的生长；而抗氧剂2246在5 mg/mL时才能引起兰州百合幼苗发生以上生理生化的改变，说明抗氧剂2246对兰州百合幼苗体内生理生化特性的影响较小。

3.3 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液对兰州百合幼苗生长的影响

目前，多数学者在研究化感自毒作用时是立足于被分离物质，在单独验证化感物质作用后，开展化感物质混合物的互作效应研究。张文明等[26]研究发现，棕榈酸和邻苯二甲酸二丁酯在0.5和1 mmol/L条件下对马铃薯的生长均产生抑制作用，且在1 mmol/L时的抑制作用远远大于0.5 mmol/L，但是2种物质混合试验中马铃薯的生长并未表现出显著差异，说明二者混合对马铃薯的生长未表现出协同效应。本试验结果显示，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246的0.2 及5 mg/mL混合液对兰州百合幼苗不同的生长指标具有不同的影响效应，若对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246单施时对幼苗生长指标作用方向相同，在交叉试验中，二者的共同作用未表现出协同效应；而当二者单施作用方向相反时，在交叉处理中表现出了相反作用的叠加效应。本试验结果与张文明等[26]的研究结论有轻微差异，这可能是由于研究者采用的自毒物质、浓度设置、受试对象以及采用的研究手段不同所致。

3.4 对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246混合液对兰州百合幼苗生理生化特性的影响

本研究结果显示，在对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246交叉试验中，兰州百合幼苗叶片CAT、POD及SOD活性较对照未发生显著的上浮或下调，3种抗氧化酶之间相互协调发挥着正常清除自由基的功能，减轻细胞膜脂过氧化程度，从而使MDA含量未发生显著变化，且细胞内可溶性蛋白含量维持在正常水平。正常的生理机制可能是导致对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246 4种质量浓度交叉处理中兰州百合幼苗生长指标较对照均未发生显著变化的内在因素。与本试验结果不同的是，郭伟等[27]在研究N-苯基-2-萘胺(P2NA)和邻苯二甲酸(PA)3∶2的混合液对生菜抗氧化系统的影响时发现，在0～15 μg/mL，生菜CAT、SOD和POD活性均增强，MDA含量降低；在20 μg/mL以上，抗氧化酶活性降低，膜脂过氧化程度升高，且P2NA和PA混合处理对膜脂过氧化的作用强于两者的单独作用。这一差异的产生可能是由于不同的作物在不同化感物质的作用下其生理响应机制不同所致。

4 结 论

单施条件下，对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246对兰州百合幼苗的生长均具有“低促高抑”效应，但二者的作用程度有所不同；与单施作用相比较，若两成分单施作用方向相同，共施条件下均未表现出同方向的协同效应，而当单施作用方向相反，共施时表现出相反作用的叠加效应。自毒作用的研究是一个复杂的过程，不同的作物、多样的生态环境、多种的结构成分以及与浓度的相互关系、不同物质间的互作效应等诸多因素均为自毒作用的研究造成了很大的困难。本试验中仅选择了在前期试验中鉴定出的对苯二甲酸二辛酯和抗氧剂2246[28-29]进行了互作效应研究，但在实际过程中，多种成分的并存以及相互之间的协同、叠加、拮抗等多重作用才是引起自毒效应的根本原因。所以，对于前期鉴定出的其他化合物是否具有自毒作用以及它们之间的效应关系如何，还有待于进一步的研究与检测。