不同胃黏膜病变中livin、survivin、Pak-1和caspase-7的表达及其意义

姜姝羽 任丽梅 武金宝 娄佳欣 苏琪皓 刘小芳

内蒙古科技大学包头医学院1(014040) 包头医学院第二附属医院消化内科2

胃癌是目前世界上常见的恶性肿瘤之一，其组织学演变遵循Correa级联反应，即慢性非萎缩性胃炎(chronic non-atrophic gastritis, CNAG)-慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)-胃黏膜肠化生-异型增生-胃癌，其中肠化生是重要的癌前病变[1-2]。Livin和survivin均属于凋亡抑制蛋白家族，是细胞凋亡中重要的调节因子，可抑制凋亡信号转导过程中的caspase-3/7/9蛋白的活性[3]。p21蛋白活化激酶-1(p21 activated kinase-1, Pak-1)是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[4]。本研究通过采用免疫组化染色检测胃癌及其癌旁、肠化生、CNAG组织中livin、survivin、Pak-1和caspase-7的表达，旨在探讨三者在胃癌发生、发展过程中的作用，从而为胃癌的预防和诊疗提供理论基础。

材料与方法

一、材料来源

选取2015年1月—2019年12月包头医学院第二附属医院病理科确诊的45例原发性胃腺癌组织和相应癌旁组织(距肿瘤组织5 cm以上)，其中男25例，女20例；年龄45～80岁，平均62岁；低分化24例，中分化14例，高分化7例；肿瘤分期根据美国癌症分期联合委员会(AJCC)的第8版胃癌TNM分期，Ⅰ+Ⅱ期者16例，Ⅲ+Ⅳ期者29例。所有组织均在外科手术或内镜黏膜下剥离术中获取。另选取经病理检查确诊的CNAG组织45例、肠化生组织45例，均无其他恶性肿瘤史，术前未行任何抗癌治疗。所有患者中男72例，女63例，年龄40～80岁，平均60岁。本研究方案已通过包头医学院第二附属医院医学伦理委员会审批。

二、主要试剂

Livin、survivin、Pak-1和caspase-7兔抗人多克隆抗体(工作浓度均为1∶400)均购于美国Proteintech Group, Inc.，免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

三、免疫组化法

对组织切片先后进行免疫组化PV-9000二步法染色、DAB显色、苏木精复染、封片等，详细步骤依照试剂盒说明书操作。以PBS液代替一抗作为空白对照，已知阳性组织切片作为阳性对照。

结果判断：采用双盲法，由2名经验丰富的病理科医师独立观察，若计数相差10%以上则重新计数。Livin、survivin主要表达于细胞质和(或)细胞核中，Pak-1主要表达于细胞质和(或)细胞膜中，caspase-7主要表达于细胞质中。高倍镜(×400)下随机选取5个视野进行观察，总染色评分为阳性细胞比例评分与染色强度评分之积，阳性细胞比例评分标准：<5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；75%，4分。染色强度评分标准：基本不着色，0分；浅黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。总评分0～2分为阴性表达，≥3分为阳性表达。

四、统计学分析

采用SPSS 25.0统计学软件，率的比较采用χ2检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组livin、survivin、Pak-1和caspase-7表达情况

在不同胃黏膜组织中，livin的阳性染色主要位于细胞质和(或)细胞核(图1)，survivin的阳性染色主要位于细胞质和(或)细胞核(图2)，Pak-1的阳性染色主要位于细胞质和(或)细胞膜(图3)，caspase-7的阳性染色主要位于细胞质(图4)。

A：胃癌；B：肠化生；C：CNAG；D：癌旁组织图1 Livin在不同胃黏膜组织中的表达(免疫组化染色，×100)

A：胃癌；B：肠化生；C：CNAG；D：癌旁组织图2 Survivin在不同胃黏膜组织中的表达(免疫组化染色，×100)

A：胃癌；B：肠化生；C：CNAG；D：癌旁组织图3 Pak-1在不同胃黏膜组织中的表达(免疫组化染色，×100)

A：胃癌；B：肠化生；C：CNAG；D：癌旁组织图4 Caspase-7在不同胃黏膜组织中的表达(免疫组化染色，×100)

胃癌组livin、survivin、Pak-1的阳性表达率明显高于肠化生组、CNAG组和癌旁组(P<0.05)，肠化生组又明显高于CNAG组和癌旁组(P<0.05)，而CNAG组与癌旁相比无明显差异(P0.05)。胃癌组caspase-7的阳性表达率明显低于肠化生组、CNAG组和癌旁组(P<0.05)，肠化生组又明显低于CNAG组和癌旁组(P<0.05)，而CNAG组与癌旁组相比无明显差异(P0.05；表1)。

表1 各组中livin、survivin、Pak-1和caspase-7表达情况n(%)

二、Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表达与胃腺癌临床病理特征的关系

Livin、survivin、Pak-1和caspase-7表达与胃癌患者分化程度、TNM分期、浸润深度和有无淋巴结转移均密切相关(P<0.05)，而与胃癌患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P0.05；表2)。

讨 论

Livin通过拮抗caspase-3、caspase-7、caspase-9和第2个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂/低等电位点的凋亡抑制蛋白的直接结合蛋白的活性来抑制肿瘤细胞凋亡[5]。本实验结果表明，livin的阳性表达率在胃癌组、肠化生组、CNAG组和癌旁组中呈下降趋势，且胃癌组中阳性表达率明显高于肠化生组、CNAG组和癌旁组，这与孟加榕等[6]的研究结果一致。同时，肠化生组livin阳性表达率又明显高于CNAG组和癌旁组，而CNAG组与癌旁组无明显差异。提示livin表达上调可能在胃黏膜由炎症向肠化生以及恶性转化中扮演重要角色，肠化生可能是胃黏膜由良性病理阶段向胃癌阶段发展的危险过渡阶段，是进行干预的最佳节点。

Survivin通过抑制caspase-3和caspase-7的活性抑制细胞凋亡，还通过调节细胞周期对抗G2/M期凋亡的诱导，使细胞逃离凋亡检查点。此外，survivin还与血管内皮生长因子共同调节肿瘤血管，促进肿瘤生成[7-8]。本实验结果表明，survivin的阳性表达率在胃癌组、肠化生组、CNAG组和癌旁组中呈下降趋势，且胃癌组中阳性表达率明显高于肠化生组、CNAG组和癌旁组，这与董丽丽等[9]的研究结果一致。同时，肠化生组survivin阳性表达率又明显高于CNAG组和癌旁组，而CNAG组与癌旁组无明显差异。提示在慢性胃炎向胃癌演变的过程中，survivin蛋白的凋亡抑制作用逐步加强，部分异常细胞失去survivin介导的凋亡控制，导致细胞凋亡与增殖失衡，从而发生胃癌。

Pak-1由一个C末端激酶区和一个N末端调节区构成，其N末端调节区含有GTP酶结合区域，参与细胞表面和细胞内各种信号级联过程，从而影响细胞周期、增殖与凋亡、炎症发生、代谢等生理过程[10]。本实验结果表明，Pak-1的阳性表达率在胃癌组、肠化生组、CNAG组、癌旁组中呈下降趋势，且胃癌组中Pak-1的阳性表达率明显高于癌旁组，这与李清[11]的研究结果一致。同时，肠化生组阳性表达率又明显高于CNAG组和癌旁组，而CNAG组与癌旁组无明显差异。提示Pak-1表达上调可能在胃黏膜炎症向肠化生和恶性转化中扮演重要角色，说明Pak-1蛋白表达是一个胃黏膜癌变的早期分子事件。

目前关于caspase-7在胃组织中的研究较少，其可能通过线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路这三种方式诱导细胞凋亡[12]。本实验结果表明，caspase-7的阳性表达率在胃癌组、肠化生组、CNAG组和癌旁组中呈升高趋势，且胃癌组中caspase-7阳性表达率明显低于肠化生组、CNAG组和癌旁组，与杨彬等[13]的研究结果一致。同时，肠化生组阳性表达率又明显低于CNAG组和癌旁组，而CANG组与癌旁组无明显差异。提示caspase-7蛋白表达下调参与了胃癌的发生、发展过程。

本研究表明肠化生组livin、survivin、Pak-1的阳性表达率明显高于CNAG组和癌旁组，胃癌组又高于肠化生组，说明livin、survivin、Pak-1异常表达发生于肠化生早期，阻断其表达可能对胃癌的发生起有一定的抑制作用。后续实验将对肠化生严重程度进行分级，同时增加异型增生组、低级别、高级别上皮内瘤变组，并检测Ki-67进行进一步研究。本研究还发现livin、survivin、Pak-1、caspase-7蛋白表达与胃癌组织分化程度、肿瘤TNM分期、浸润深度和淋巴结转移相关(P<0.05)，提示上述蛋白表达强度可反映肿瘤的恶性程度与转移程度，有可能成为评价胃癌发展和预后的参考指标之一，可能是有潜在价值的肿瘤标志物和肿瘤治疗的新靶点。考虑2种及以上基因相互影响的具体作用机制尚不明确，为提供更多的参考依据以证明多基因之间存在协同作用，还需进一步在分子水平上进行研究。

综上所述，livin、survivin、Pak-1和caspase-7可能成为胃腺癌临床诊断、判断疗效和监测预后的指标之一。