玫烟色棒束孢NBL-Z8的培养及对桃蚜的侵染力

齐素敏 陈丹丹 李圆圆 冉新炎 韩广泉 陶宁 王丽荣

摘要：通过探索玫烟色棒束孢NBL-Z8的最佳培养条件并测定该菌对桃蚜[Myzus persicae （Sulzer）]的侵染力，以期为筛选出对桃蚜具有高毒力的微生物杀虫剂提供依据。采用单因素分析法测定菌株的最佳培养条件，并采用喷雾法测定菌株NBL-Z8对桃蚜的致病力。结果显示，NBL-Z8菌株的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为蛋白胨，最佳培养条件为温度25 ℃、初始pH值7、转速180 r/min、接种量6%;菌株的室内致病力测定结果表明，当孢子浓度为1×108 CFU/mL 时，对桃蚜的致死中时间（LT50）为3.118 d，接菌7 d时致死中浓度（LC50）为1.367×104 CFU/mL。由研究结果可以看出，玫烟色棒束孢NBL-Z8对桃蚜具有较强的致病力，可作为桃蚜生防制剂开发中的潜力菌株。

关键词：玫烟色棒束孢;液体培养;桃蚜;侵染力测定;生防潜力

中图分类号： S433.39;S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）10-0082-04

蚜虫类有13科、500余属，目前世界上已知种类有4 700余种，而我国已知的蚜虫种类就有1 000余种[1]。桃蚜（Myzus persicae）是常见的一种蚜虫，该虫以成虫、若虫群集在寄主叶片、花梗和种荚等部位吸食汁液危害寄主，常导致寄主叶片黄化、蜷缩甚至枯萎，并分泌蜜露诱发煤烟病，引起寄主植株品质和产量下降[2-3]。目前，化学防治仍是控制蚜虫危害的主要方法，而频繁地使用高剂量化学杀虫剂，不仅会导致蚜虫对多种农药产生不同程度的抗性[4-7]，还会造成蔬菜中的农药残留超标，给农产品安全生产带来隐患。因此，研究和开发能够减少化学杀虫剂用量甚至替代化学杀虫剂的安全、高效的生物防治方法成为桃蚜综合防治的重要途径。

玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）是一种重要的昆虫病原真菌，该菌地理分布范围广泛，昆虫寄主多样，能寄生在同翅目、鳞翅目、双翅目等8个目40多种昆虫上[8]。大量研究结果表明，玫烟色拟青霉对蚜虫等刺吸式口器害虫具有很强的致病力。曹娜在大田试验中采用1.0×107个/mL玫烟色棒束孢孢子悬浮液喷雾防治棉蚜，第10天时的校正防效可达95.9%[9]。朱丽梅等的研究结果表明，玫烟色棒束孢QH4对桃粉蚜的毒杀效果较好，施药后120 h的死亡率可达100%[10]。邓建华等研究发现，用玫烟色棒束孢孢子悬浮液处理后第10天，烟蚜的感染率为78.5%[11]。孙莉等用108个/mL玫烟色棒束孢孢子悬浮液处理蚜虫，结果显示，试虫在施药后第10天的死亡率可达86.52%[12]。邢培翔等用108个/mL玫烟色棒束孢孢子悬浮液处理梨黄粉蚜，7 d后的校正死亡率为97.24%[13]。綜合以上研究结果可知，玫烟色棒束孢对多种蚜虫具有良好的防治效果。笔者优化了玫烟色棒束孢 NBL-Z8 的液体培养条件并测定该菌对桃蚜成虫的室内毒力，以期筛选出对桃蚜具有高毒力的微生物杀虫剂，为减少化学药剂使用量、缓解昆虫抗药性、实现农业害虫的无公害防治、提高农产品的安全性提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 玫烟色棒束孢菌株NBL-Z8从山东省泰安市省庄周边土壤中分离纯化所得，该菌株目前保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC19603。

1.1.2 供试虫源 桃蚜采自山东省泰安市泰山区省庄周边白菜叶片，在温度为（25±1） ℃、相对湿度为（80±5）%、光—暗周期为12 h—12 h的条件下，采用无农药及害虫污染的甘蓝饲养，人工饲养多代。取大小一致的健康的无翅成蚜作为试虫。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基配方：200 g马铃薯（去皮），20 g葡萄糖，20 g 琼脂，1 000 mL蒸馏水;PDB（不加琼脂的PDA）培养基配方：200 g马铃薯（去皮），20 g葡萄糖，1 000 mL蒸馏水。

1.2 最适培养条件筛选的单因素试验

以A培养基（25.0 g/L葡萄糖，6.0 g/L蛋白胨，2.0 g/L K2HPO4，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4）作为对照，采用单因素试验法分别研究玫烟色棒束孢在以不同碳源（葡萄糖、蔗糖、甘露醇、柠檬酸钠和糖蜜）、氮源（蛋白胨、硝酸钾、酵母膏、氯化铵和牛肉浸膏）为主要成分的培养基中及不同发酵初始pH值（3、5、7、9、11）、发酵温度（15、20、25、28、30 ℃）、转速（150、170、180、200、220 r/min）和接种量（3%、4%、5%、6%、7%）条件下的发酵效果。发酵条件同原始条件，即初始pH值为7.0，接种量为6%，接种液浓度为108 CFU/mL，培养温度为25 ℃，摇床转速为180 r/min，培养48 h后采用血细胞计数板测定菌株的孢子浓度。

1.3 孢子悬浮液的配制

将保存在4 ℃斜面上的供试菌株活化后，接种到PDA培养基平板上，于25 ℃培养10 d后，用含有0.05%吐温-80的无菌水冲洗孢子，然后用血球计数板测定悬浮液中的孢子数，计算其孢子浓度，再用含有0.05%吐温-80的无菌水逐步稀释，获得浓度为1×104～1×108 CFU/mL的孢子悬浮液。

1.4 室内毒力测定

试验于2020年3月在山东省泰安市植物微生态制剂重点实验室进行。配制水琼脂培养基（1.5 g琼脂，100 mL蒸馏水），每个培养皿10～15 mL，待冷却后，剪取大小一致的甘蓝叶片（圆形，直径为 4 cm），将叶背朝上紧贴在培养基表面使其固定，再将无翅成蚜转移到培养皿中的叶片上，每个培养皿中放20头。 将上述浓度为1×104～1×108 CFU/mL的孢子悬浮液用喷雾器进行喷雾，每个培养皿定量喷雾1次。用含有0.05%吐温-80的无菌水作为对照（CK），每次处理用20头蚜虫，每个处理重复3次。自然风干后加盖，在（25±1） ℃、相对湿度为（80±5）%、光—暗周期为12 h—12 h的条件下逐日观察并记录病死虫数至蚜虫死亡，及时挑出死亡虫体并于灭菌培养皿中保湿培养，3～5 d后镜检死虫，观察是否产生菌丝或孢子，以确定是否是因为有效感染玫烟色棒束孢菌而导致的死亡。

1.5 数据统计与分析

用Excel 2010、SPSS 19.0对数据进行处理，并用Duncans新复极差法进行显著性分析和Probit回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素筛选最适培养条件

2.1.1 单因素试验法筛选最适培养基 基础培养基选择A培养基（25.0 g/L葡萄糖，6.0 g/L蛋白胨，2.0 g/L K2HPO4，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4），测定不同碳源、氮源对菌株NBL-Z8孢子浓度的影响。由表1可以看出，分别以蔗糖为碳源、蛋白胨为氮源时，菌株NBL-Z8可以获得最大孢子浓度，分别为4.31×108、3.57×108 CFU/mL，且显著高于其他处理。因此，确定将蔗糖、蛋白胨为最优发酵培养基成分。

2.1.2 单因素试验法筛选最适发酵条件 如表2所示，当初始pH值为7时，菌株NBL-Z8的孢子浓度显著高于其他处理，可见过酸或过碱的培养基均会影响菌株的产孢性能。菌株NBL-Z8在温度为 15～30 ℃范围内的产孢性能良好，温度过高或过低均不利于该菌产孢，菌株在温度为25 ℃时的孢子浓度最大。当摇床转速为200 r/min时，孢子浓度最大，但菌株在转速超过200 r/min时，摇瓶中的菌株存在起泡、菌丝结球的现象，但是考虑到转速为200、180 r/min时，菌株的孢子浓度不存在显著性差异，因此所以选择180 r/min为最佳转速。当菌株 NBL-Z8的接种量在3%～6%之间时，其菌体孢子浓度随着接种量的增大而增加，当接种量为6%时，孢子浓度最大，为4.31×108 CFU/mL。

2.2 菌株对桃蚜的室内毒力

表3中结果显示，不同浓度的玫烟色棒束孢NBL-Z8孢子悬浮液对桃蚜的校正死亡率从处理 2 d 后（1 d后的校正死亡率为0%）起开始出现显著性差异（P<0.05）。1×104 CFU/mL浓度的孢子悬浮液对桃蚜的致死率较低，处理7 d后，校正死亡率仅为48.44%，致死中时间（LT50）为6.287 d;1×107 CFU/mL浓度的孢子悬浮液对桃蚜的致死率较高，处理7 d后时，校正死亡率可以达到88.33%，LT50为3.302 d;浓度为1×108 CFU/mL的孢子悬浮液处理组的效果最好，处理6 d后时，校正死亡率可达90%以上，LT50为3.118 d。

由表4中的数据可以看出，处理2～7 d后，不同处理下该菌对桃蚜的致死中浓度（LC50）分别为1.675×1013、1.038×108、3.653×105、3.584×104、1.660×104、1.367×104 CFU/mL。

上述結果表明，菌株NBL-Z8对桃蚜的致死率随着孢子悬浮液浓度的增加而明显提高，并且随着处理时间的延长而增大，但是在不同浓度处理下，桃蚜的死亡率基本在4 d后达到1个峰值，随后致死率的增加趋势变缓，说明玫烟色棒束孢NBL-Z8菌株可以在较短时间内造成桃蚜成虫死亡。

3 讨论

研究发现，孢子浓度是筛选优良菌株的重要指标，而菌株培养条件对菌种孢子浓度及毒力均有较大影响[14]。因此探索菌株NBL-Z8的最佳产孢条件，对于利用该菌防治害虫具有重要意义。张仙红等研究发现，葡萄糖是玫烟色拟青霉液体培养的最适碳源，蛋白胨是最适氮源[15]。曹娜研究发现，萨氏液体培养基（SDY培养基）是最佳发酵培养基[9]。本研究发现，菌株NBL-Z8的最佳碳源、氮源分别为蔗糖、蛋白胨，这与田晶的研究结果[16]一致。本研究发现，该菌株的最佳产孢条件为温度25 ℃、初始pH值7、转速180 r/min、接种量6%、培养时间48 h。在接下来的试验中，笔者将进一步探究各营养成分对玫烟色棒束孢NBL-Z8生长和生殖的影响。

用微生物或其代谢产物防治农业害虫具有选择性强、对农作物和自然环境安全、不伤害天敌、不易产生抗性等优点，已经逐渐引起人们的重视。研究发现，白僵菌、绿僵菌[17-19]、蜡蚧轮枝菌[20-21]、达旦提狄克氏菌[22-23]等生防菌株对蚜虫均具有良好的防治效果。据报道，玫烟色棒束孢对桃蚜具有较高的致病力[24-26]。本研究发现，菌株NBL-Z8在孢子浓度为1×107、1×108 CFU/mL时对桃蚜的致死率较高，处理7 d后，试虫的校正死亡率分别为88.33%、96.89%，LT50分别为3.302、3.118 d，LC50为1.367×104 CFU/mL，该致死中浓度低于陈巍巍等测得的8.51×105 CFU/mL[24]、张仙红等测得的8.71×106 CFU/mL[25]及孟豪等研究得出的1.20×105 CFU/mL[26]。以上结果表明，玫烟色棒束孢 NBL-Z8对桃蚜的生物防治潜力较大。此外，大量研究表明，玫烟色棒束孢对烟粉虱[27-29]、柑橘木虱[30-31]、小菜蛾[32]和朱砂叶螨[33]等多种害虫具有较强的侵染力，是一种性能优良的昆虫病原真菌。

目前国外已经筛选出具有高致病力的菌株，自20世纪60年代以来，已经有10种玫烟色棒束孢制剂产品获得注册登记[34]，而国内尚未出现商品化的玫烟色棒束孢制剂。因此，今后的工作重点是进行商品化研究，包括生产发酵技术、大田施用技术及田间评价体系等，可以为害虫的综合防治提供产品和技术支持。

4 结论

玫烟色棒束孢NBL-Z8对桃蚜具有较强的室内毒力，可作为桃蚜生防制剂开发的潜力菌株。

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