基于网络药理学及分子对接探讨雷公藤治疗肝癌的作用机制*

朱文豪，周 青，童东昌，张 振，郭垠梅，宁迪敏，黄 振，郑 飘，田雪飞△

(1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

原发性肝癌(以下简称肝癌)是指发生在肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，是我国最常见的恶性肿瘤之一。肝癌在我国恶性肿瘤发病率中居第4位，死亡率居第2位，每年大约有60万人死于肝癌，是导致死亡最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前，临床上肝癌的治疗手段包括手术切除、介入治疗、放化疗、靶向治疗等，但受化疗毒副反应大、靶向治疗耐药比例高等因素的影响，整体治疗效果并不理想、5年生存率较低。而近年来，中药已被证实可通过多途径抑制肝癌细胞生长、增殖，在肝癌治疗上效果显著[2]。研究证实，雷公藤中雷公藤甲素等活性成分能显著抑制肝癌细胞增殖，可能与抑制Ras蛋白表达有关[3]。本研究通过运用网络药理学方法及分子对接技术构建“雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”互作网络，并对结果加以验证，探讨雷公藤有效活性成分治疗肝癌的作用机制，进一步为中药治疗肝癌提供方向和思路。研究流程图见图1。

图1 研究流程图

1 资料与方法

1.1 数据库、软件、分析平台 本研究所应用的数据库、软件、分析平台具体信息见表1。

表1 数据库、软件、分析平台

1.2 方法

1.2.1 雷公藤活性成分及靶点筛选 在TCMSP数据库中检索雷公藤的主要活性成分，依据口服利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18进行活性成分筛选，根据结果查询对应靶点，并使用UniProt数据库将查询所得靶点转换成geneSymbol。

1.2.2 肝癌靶点筛选 通过DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD数据库以“liver cancer”为关键词进行检索，汇总、并集、去重后获得肝癌相关靶点。

1.2.3 雷公藤治疗肝癌靶点的筛选 利用R语言软件将雷公藤活性成分相关靶点和肝癌相关靶点进行匹配映射，并绘制韦恩图，获得雷公藤潜在治疗肝癌靶点。

1.2.4 构建雷公藤治疗肝癌靶点PPI网络 将雷公藤治疗肝癌相关靶点输入STRING数据库，构建治疗靶点 PPI网络，“highest confidence”设为“＞0.9”，将结果以TSV格式导出，应用R语言软件计算靶点互作频次且绘制柱状图。

1.2.5 构建“雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”网络 采用Cytoscape3.8.2软件构建“雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”互作网络图。

1.2.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析 应用R语言软件对所获雷公藤治疗肝癌靶点进行GO功能分析和KEGG 通路富集分析(P＜0.05，Q＜0.05)，并将结果以气泡图形式输出。

1.2.7 分子对接 为了从分子水平阐明与化合物的作用模式，我们将活性成分对接至蛋白口袋。从PubChem数据库下载互作网络中靶点数排名前5的活性成分mol2格式3D结构，RCSB PDB数据库下载柱状图中排名前5的蛋白三维结构，应用Autodock vina进行半柔性对接，选取对接结合能量最低的构象用于对接结合模式分析，并使用PyMOL进行作图。

2 结果

2.1 雷公藤活性成分、靶点获取及筛选 在TCMSP数据库中检索雷公藤共获得活性成分144个，根据上述方法中所设定的条件对雷公藤的有效成分进行筛选，共得到雷公藤的潜在活性成分51个，见表2。将活性成分对应的靶点输入UniProt数据库，共筛选出121个药物靶点。

表2 雷公藤活性成分

2.2 肝癌靶点筛选 使用 DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD数据库以“liver cancer”为关键词进行检索，分别获取 6，16 670，416，63 个靶点，4 个数据库共有17 155个靶点，去重后共有16 707个靶点。

2.3 雷公藤治疗肝癌靶点筛选 应用R语言软件将121个雷公藤活性成分相关靶点和16 707个肝癌相关靶点进行匹配映射，绘制韦恩图，见图2，两者取交集后获得雷公藤潜在抗肝癌靶点120个。

图2 雷公藤治疗肝癌靶点韦恩图

2.4 雷公藤治疗肝癌靶点PPI网络构建 应用STRING网站构建治疗靶点PPI网络，互作网络中共有节点102个，其中有18个靶点出现离散，边数328条，见图3。应用R语言软件计算靶点互作频次且绘制柱状图，见图4。靶点互作频次较高的有AKT1、VEGFA、CXCL8、JUN、PTGS2，表明雷公藤活性成分与其有较高的结合活性，可作为雷公藤治疗肝癌的关键靶点。

图3 雷公藤治疗肝癌靶点PPI网络

图4 雷公藤治疗肝癌靶点互作频次图

2.5 “雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”网络模型构建及分析 将雷公藤活性成分与雷公藤潜在治疗肝癌靶点输入Cytoscape3.8.2软件中，绘制“雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”互作网络图，见图5。结果显示，雷公藤中主要活性成分为山柰酚(kaempferol)、雷公藤甲素(triptolide)、川陈皮素(nobiletin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)，这几种活性成分可能在肝癌的治疗上发挥主要作用。

图5 “雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”互作网络图

2.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析 应用R语言软件对治疗靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析。结果显示，治疗靶点主要涉及酰胺结合、肽结合、DNA结合转录因子结合等生物学过程，见图6，并主要富集于卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、流体剪切应力和动脉粥样硬化等信号通路中，见图7。提示雷公藤可能通过多个生物学过程、多条通路发挥抗肝癌作用。其中，气泡的面积与富集到的靶点数量呈正相关，气泡的颜色由蓝色转红色提示p值由大至小。故红色气泡面积越大，表明该信号通路的显著性越高。

图6 GO功能分析气泡图

图7 KEGG通路富集分析气泡图

2.7 分子对接结果 分子对接验证显示对接得分大于-5kcal/moL者占100%，即所有靶点与成分的结合活性较好。对接得分见表3，对接得分热图见图8。红色越深说明活性成分与靶点对接得分越大。部分靶点与成分对接示意图见图9，如山柰酚与PTGS2对接得分为-9.2kcal/moL，化合物与氨基酸残基SER-49形成键长为 2.1Å、2.3Å、1.9Å、2.5Å 的氢键作用，TRP-323形成键长为2.0Å的氢键作用，ASN-34形成键长为2.1Å、2.3Å的氢键作用，PRO-153形成键长为2.7Å的氢键作用，GLN-461形成键长为2.7Å的氢键作用，见图9A；雷公藤甲素与VEGFA对接得分为-7.1kcal/mol，化合物和氨基酸残基PHE-47形成键长为2.0Å的氢键作用，见图9B；川陈皮素与PTGS2对接得分为-8.4kcal/mol，化合物和氨基酸残基TYR-130、ASN-34、HIS-39 分别形成键长为 2.7Å、2.1Å、1.9Å的氢键作用，见图9C。

表3 分子对接得分

图8 分子对接热图

图9 分子对接相互作用示意图

3 讨论

肝癌归属于中医学“癥瘕”“积聚”“鼓胀”等范畴。《灵枢·水胀》中“鼓胀何如？岐伯曰：鼓胀身皆大，大与肤胀等也，色苍黄，腹筋起，此其候也。”[4]对肝癌的临床表现进行了描述，而其病因病机则主要为“虚”“毒”“瘀”[5]。雷公藤为卫矛科雷公藤属植物，现代药理学作用主要包括抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等[6-7]。既往研究发现，雷公藤可通过调控细胞生长周期、血管内皮生长因子受体、血管生成、细胞增殖和凋亡等机制发挥抗肿瘤作用[8-9]。

本研究通过网络药理学方法进行“雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”网络构建与分析，发现雷公藤治疗肝癌的主要活性成分为山柰酚、雷公藤甲素、川陈皮素、β-谷甾醇、豆甾醇。研究表明，山柰酚可通过促进P62的沉积及诱导凋亡经典途径中NLRP3的合成，从而抑制HepG2肝癌细胞增殖、自噬并诱导其凋亡[10]。雷公藤甲素亦可通过调控HIF-1α介导的糖酵解途径[11]、降低肝癌侧群细胞成球及成瘤能力[12]抑制肝癌细胞增殖。川陈皮素[13]可显著抑制肝癌细胞增殖，使细胞停滞在G2/M期，诱导其发生浓度依赖性凋亡。β-谷甾醇可抑制肝癌细胞生长，并通过线粒体途径及膜死亡受体途径诱导细胞凋亡[14]。β-谷甾醇、豆甾醇均可明显抑制肝癌细胞增殖，使细胞形态发生典型凋亡变化[15]。而分子对接结果显示，山柰酚、雷公藤甲素与关键靶点JUN、PTGS2结合活性较好，说明雷公藤可能主要通过山柰酚、雷公藤甲素发挥抗肝癌作用。

本研究发现雷公藤治疗肝癌的关键靶点为AKT1、VEGFA、CXCL8、JUN、PTGS2。研究表明，雷公藤红素可抑制AKT/c-Met肝癌小鼠AKT/mTORC1/FASN通路及ERK1/2的磷酸化，进而抑制肝癌细胞异常增殖发挥抗肝癌作用[16]。miR-16-5p[17]、miR-206[18]靶向VEGFA可抑制HepG2肝癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT过程，而USP22[19]可通过上调VEGFA基因转录促进肝癌细胞增殖、肿瘤生长及血管生成拟态。研究表明，肝癌患者血清中CXCL8呈高表达，CXCL8/CXCR1信号轴可通过激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路促进肝癌细胞存活以及发生侵袭转移，而细胞免疫治疗则可下调CXCL8、CXCR1/2的过度表达，降低过度分泌CXCL8所致的炎症反应，发挥抗癌作用[20]。抑制JNK/c-Jun信号通路可抑制转录因子AP-1的活性，从而抑制肝癌细胞的增殖侵袭转移[21]。研究表明，PTGS2的消融会逆转T细胞排斥，并使肿瘤对免疫治疗敏感[22]，而目前关于雷公藤通过影响PTGS2来发挥抗肝癌作用的研究未见报道，而PTGS2作为雷公藤发挥抗肝癌作用的关键靶点，值得深究。

本研究显示，潜在治疗靶点主要涉及酰胺结合、肽结合、DNA结合转录因子结合等生物学过程，并主要富集于卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、流体剪切应力和动脉粥样硬化等信号通路中。既往研究表明，以氟喹诺酮骨架为酰胺基功能修饰基，以酰胺基为氟喹诺酮C-3位羧基的生物电子等排体设计合成的氟喹诺酮-3-N-酰胺类化合物的抗肿瘤活性均显著强于母体[23]。卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染与卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤发病相关密切[24]，且卡波西肉瘤相关疱疹病毒K12基因体外可转化小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞，体内可诱导肿瘤的形成[25]。研究表明，我国肝癌的发生主要与乙肝病毒感染有关，其已成为诱发肝癌的独立危险因素[26-27]。

综上所述，通过网络药理学的研究方法及分子对接技术构建“雷公藤-活性成分-靶点-肝癌”互作网络，对雷公藤多成分、多靶点、多通路进行分析，初步验证了雷公藤治疗肝癌的基本药理学作用和作用机制，为雷公藤治疗肝癌的进一步研究提供思路。然而网络药理学研究无论是数据挖掘、药物与靶点相似性算法等，都存在诸多不足，如药物与靶点关联性差，靶点数据库信息不全，相似性算法精度不高等[28-29]。因此，高标准、高精度、高智能化的中药化学数据库以及靶点预测工具，多成分、多靶点、多途径的数据挖掘技术，并结合体内实验验证，将是今后中药网络药理学研究发展的主要方向。