加州鲈源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及耐药性分析

陈绮梨 常藕琴 张德峰 任燕 石存斌

摘要：【目的】明確引起佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地加州鲈（Micropterus salmonoides）体表出血和溃烂的病原菌，并进行药物敏感性分析，为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。【方法】采用常规细菌分离方法从患病加州鲈的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离病原菌，经革兰氏染色和磷钨酸负染后，使用光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态及其染色特性;通过ATB Expression生化鉴定仪和Biolog微生物自动鉴定系统进行生理生化特性鉴定，基于16S rRNA序列和gyrB基因序列进行分子生物学鉴定，经人工回归感染试验和组织病理学观察进一步确定病原菌的致病性及其对组织细胞的损伤，同时以K-B纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患病加州鲈肝脏中分离获得1株优势菌株（180803bj_jzl），为周鞭毛的革兰氏阴性杆菌，Biolog微生物系统自动鉴定其为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）的可能性高达99.4%;基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性构建的系统发育进化树均显示，分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类为一支，与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上，gyrB基因序列相似性则在91.00%以上。人工回归感染7 d内的累积死亡率达60%，临床症状与自然发病加州鲈的症状基本相同;其肝脏组织中央静脉和肝窦有红细胞淤积，肝细胞质内有大量空泡，呈散在变性坏死;脾脏的白髓与红髓分界不清，脾窦和脾小血管内有嗜铁血红素中心;鳃小片上皮细胞与毛细血管分离，呈球拍状，部分上皮细胞坏死脱落，只残存少量鳃小片骨架。分离菌株180803bj_jzl对氟罗沙星、氧氟沙星、大观霉素、新霉素、庆大霉素、恩诺沙星和诺氟沙星等7种抗菌药物敏感，对多西环素、四环素、乙酰螺旋霉素、罗红霉素、头孢氨苄和阿莫西林等15种抗菌药物已产生耐药性。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起加州鲈体表出血和溃疡，且具有较强的毒力，致使肝脏、脾脏和鳃等组织病理损伤，实际生产中可选用新霉素和恩诺沙星等渔用抗菌药物进行防治。

关键词：  加州鲈;弗氏柠檬酸杆菌;分离鉴定;耐药性

中图分类号： S943.211                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）02-0465-10

Abstract： 【Objective】The California perch （Micropterus salmonoides） broke out with surface hemorrhage and ulceration at the breeding base of an aquatic seedling company in Sanshui， Foshan. The pathogenic bacteria and drug sensitivity were clarified， which provided scientific evidence for the clinical diagnosis and scientific prevention and control of the disease. 【Method】The pathogenic bacteria were isolated from the tissues of diseased M. salmonoides， such as the liver， spleen， kidney， by using conventional bacterial isolation methods. After Gram staining， phosphotungstic acid staining， observation of morphology and staining characteristics of bacteria using optical microscope and transmission electron microscope was conducted. ATB Expression biochemical identification instrument and Biolog Microbes Automatic Identification System were used to identify the physiological and biochemical characteristics， and molecular biology identification was conducted based on 16S rRNA sequence and gyrB gene sequence. The artificial regression test and histopathology analysis were applied to further determine the pathogenicity of the bacteria and tissue damage， and its antibiotic susceptibility was tested by Kirby-Bauer disc diffusion. 【Result】A dominant strain 180803 bj_jzl was isolated from the liver of diseased M. salmoides. It was gram-negative rod-shaped bacteria with periflagellum. The biochemical characteristics were identified as the same as Citrobacter freundii up to 99.4 % by the Biolog Microbes Automatic Identification System. Phylogenetic tree based on homology of 16S rRNA and gyrB gene sequences revealed that isolated strain 180803bj_jzl clustered with the same branch of C. freundii. The 16S rRNA sequence similarity with the reference strains of C. freundii published by GenBank was more than 99.00%， and the similarity of the gyrB gene sequence was more than 91.00%. The cumulative mortality rate within 7 d of artificial recurrent infection was 60%， and its symptoms were basically the same as those of naturally-occurring M. salmoides. There were the erythrocytes congestion in the central vein and hepatic sinusoids of liver tissue， and a large number of vacuoles in the hepatocyte cytoplasm. The degeneration and necrosis were scattered in liver tissue. The white pulp and red pulp had unclear boundaries. And there were ferritinophilic hemoglobin centers in the splenic sinusoids and splenic small vessels. The epithelial cells of the gill lamellae were separated from the capillaries in a racket-shaped manner， and some epithelial cells of the gill lamellae were necrotic and detached， and only a small amount of gill lamellae skeleton remained. The drug sensitivity tests showed that 180803bj_jzl isolate was  sensitive to 7 antimicrobial drugs such as fleroxacin， ofloxacin， macromycin， gentamicin， enrofloxacin and norfloxacin， and resistant to 15 antimicrobial drugs such as doxycycline， tetracycline， acetylcholine， roxithromycin， cefalexin and amoxicillin. 【Conclusion】C. freundii can cause the body surface ulceration of M. salmoides and the histopathological damage to the liver， spleen and gills， and it has strong toxicity. The fishery antibiotics， such as neomycin and enrofloxacin， can be used to prevent and treat the disease in actual production，.

Key words： Micropterus salmoides; Citrobacter freundii; isolation and identification; drug resistance

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD0900102）; 948 Program of Ministry of Agriculture（2016-X57）; Guangzhou Science and Technology Project（201904020004）

0 引言

【研究意义】加州鲈（Micropterus salmonoides）隶属于鲈形目（Perciformes）太阳鱼科（Lepomis）黑鲈属（Micropterus），是我国重要的淡水养殖品种之一。据统计，我国加州鲈养殖总产量已超过37万t（农业农村部渔业渔政管理局，2017）。随着市场需求量的增加，加州鲈养殖密度不断加大，其病害也呈逐年增加趋势。已有研究证实，多种细菌均可感染加州鲈致病，其中鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolea）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、维氏气单胞菌（A. veronii）和杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）等病原菌可引起加州鲈内脏类结节、体表出血或溃烂等症状，给养殖户带来巨大经济损失（蒋依依等，2012;龙波等，2016;陈荣盛等，2018;叶伟东等，2018）。因此，加强加州鲈病原菌分离鉴定、药敏试验及病理组织学分析，可为其病原学和病害防治提供理论依据，同时对保障加州鲈养殖业的持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）隶属于肠道杆菌科（Enterobacteriaceae）枸橼酸杆菌属（Citrobacter），为兼性厌氧菌，广泛分布于水、土壤和食物等自然界及人类和动物（哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类）的肠道内，易引起人类和动物腹泻、食物中毒及继发感染（Trinidade et al.，2010;周加利，2011），是一种典型的人—畜—鱼共患条件性致病菌（薛巧等，2015;林威等，2019）。弗氏柠檬酸杆菌可引起红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）（沈锦玉等，2005）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）（Lü et al.，2011）、大鲵（Andrias davidianus）（高正勇等，2012）、中华鳖（Trionyx sinensis）（田飞焱等，2013;苏英等，2019）、花鳗鲡（Anguilla marmorata）（杨方园等，2013）、鲟（Acipenser）（杨移斌等，2013）、罗非鱼（Oreochromis mossambicus）（胡秀彩等，2014;石征宇等，2018）、乌翅真鲨（Carcharhinus melanopterus）（卢君辉等，2015）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）（张冬星等，2016）、克氏原螯虾（肖宁等，2016）、巴西龟（Trachemys scripta elegans）（白杰等，2019）及中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）（黄晓东等，2019）等水生动物体表局部充血、出血或鳃组织充血等症状，且近年来呈危害动物种类增多、危害程度逐年加重的变化趋势。此外，弗氏柠檬酸杆菌对抗生素的敏感性因感染动物来源不同而存在明显差异（苏英等，2019），红螯螯虾源弗氏柠檬酸杆菌对复方新诺明、庆大霉素、卡那霉素及氯霉素等敏感，对强力霉素、青霉素G、四环素和红霉素已产生耐药性（沈锦玉等，2005）;团头鲂源弗氏柠檬酸杆菌对头孢噻肟较敏感，对恩诺沙星、卡那霉素及氨苄西林等抗菌药物存在不同程度的耐药性（张冬星等，2016）;中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌对新霉素、庆大霉素、链霉素、氧氟沙星及恩诺沙星等抗菌药物高度敏感，对氨苄西林、羧苄青霉素和万古霉素已产生耐药性（黄晓东等，2019）。因此，在养殖过程中若发生细菌性病害应及时进行病原菌分离鉴定和药敏试验，篩选出敏感药物有针对性地进行防治。【本研究切入点】2018年6月广东省佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地大量加州鲈的体表出血和溃烂，发病死亡率高达50%，经济损失严重，亟需明确其病因并采取有效的防治措施。【拟解决的关键问题】对患病加州鲈进行病原菌分离鉴定，并开展人工回归感染试验和组织病理学分析，采用药敏纸片法检测病原菌的药物敏感性，以期为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

患病加州鲈采自佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地，平均体质量约100.0 g，其主要临床症状表现为体表局部充血、出血和溃烂，鳃组织充血，肝脏充血肿胀，脾脏肿大。健康加州鲈与自然发病加州鲈为同一苗场的相同品系，平均体质量约100.0 g，25 ℃暂养观察1周，无任何异常症状，用于人工回归感染试验。

1. 2 病原菌分离纯化及形态学观察

无菌操作下采集患病加州鲈的肝脏、脾脏和肾脏，组织取样接种于血平板培养基和BHI琼脂培养基上。28 ℃培养18～24 h，挑取优势菌落进行纯化，结果从发病濒死加州鲈肝脏中分离获得编号为180803bj_jzl的纯化菌株，-80 ℃保存备用。以灭菌生理盐水将纯化菌株制成菌悬液，经革兰氏染色和磷钨酸负染后，分别用Nikon ECLIPSE 80i显微镜和HT7700型Hitachi透射电子显微镜观察菌体形态及其染色特性。

1. 3 病原菌生理生化特性鉴定

取200 μL菌悬液（1.5×108 CFU/mL），加入7 mL硫酸铵琼脂培养基，混匀，取样加至Bio Mereux ID 32 GN革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒的鉴定试剂条孔中，28 ℃培养24 h，采用ATB Expression生化鉴定仪判读结果。同时取Biolog微生物自动鉴定标准试剂盒IF-A接种液，移入Biolog浊度仪中，调整其读数为100%T（期望值）;用无菌棉签蘸取适量单菌落接种至接种液中，使浊度仪读数维持在92%T～98%T（期望值），每孔100 μL，移至GENⅢ鉴定板，28 ℃培养24 h，Biolog微生物自动鉴定系统读取鉴定结果。

1. 4 16S rRNA和gyrB基因扩增测序及系统发育进化分析

采用细菌基因组提取试剂盒提取病原菌基因组DNA，以通用引物（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'和5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增16S rRNA序列，并以引物[F：5'-GAAGTCATCAT GACCGTTCTGCA（C/T）GC（A/G/C/T）GG（A/G/C/T）GG（A/G/C/T）AA（A/G）TT（C/T）GA-3'和R：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC（A/G）TC（A/G/C/T）AC（A/G）TC（A/G/C/T）GC（A/G）TC（A/G/C/T）GTCAT-3']扩增gyrB基因（龙波等，2016）。PCR反应体系50.0 ?L：DNA模板1.0 ?L，上、下游引物各1.0 ?L，Master Mix 45.0 ?L，灭菌去离子水补足至50.0 ?L。扩增程序：98 ℃预变性3 min;98 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，进行35个循环，72 ℃延伸40 s。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至广州艾基生物技术有限公司测序。测序结果通过GenBank检索系统（http：//www.ncbi.nlm1nih.gov/Blast.cgi/）中的BLAST进行序列同源比对分析，并以MEGA 6.0中的邻接法（Neighobor-joining，NJ）构建系统发育进化树。

1. 5 人工回归感染试验及病理组织学观察

将分离菌株180803bj_jzl接种至BHI液体培养液中，28 ℃摇瓶（200 r/min）振荡培养18 h，3000×g离心20 min，收集菌体，采用McFarland比浊法结合平板菌落計数法测定细菌浓度，并稀释成1×109 CFU/mL的菌悬液。取10倍稀释的菌悬液（1×108 CFU/mL）浸泡感染10尾健康加州鲈，以等体积PBS浸泡的10尾加州鲈为对照。感染组和对照组的健康加州鲈均浸泡30 min，然后置于28 ℃水族箱继续饲养，连续观察7 d，记录加州鲈的死亡情况。取临床症状明显的发病加州鲈再次进行病原菌分离，剖检观察内脏病变，采集肝脏、脾脏和鳃组织，4 ℃下以4%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，RM-2145型Leica轮转式切片机连续切片（厚度3～5 μm），HE染色，显微镜观察并摄影。

1. 6 药敏试验

采用K-B纸片扩散法，将培养获得的分离菌株180803bj_jzl制成1×108 CFU/mL菌悬液，取1 mL均匀涂抹在MH琼脂培养基上，然后用无菌镊子将25种抗菌药物的药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）贴于MH琼脂培养基表面，28 ℃倒置培养18～24 h后测量各药敏纸片的抑菌圈直径。根据美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）标准判定分离菌株180803bj_jzl对药物的敏感性（Wayne，2016）。

2 结果与分析

2. 1 病原菌的形态学观察结果

分离菌株180803bj_jzl在BHI琼脂培养基上形成的菌落呈圆形、中间隆起、边缘整齐、表面光滑。革兰氏染色阴性，短杆状，两边钝圆（图1）。透射电子显微镜观察到分离菌株180803bj_jzl呈短杆状、两端钝圆，菌体大小约1.5 μm×2.7 μm，周鞭毛，无菌毛（图2）。

2. 2 病原菌的生理生化特性鉴定结果

ATB Expression生化鉴定仪鉴定结果（表1）显示，分离菌株180803bj_jzl利用葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、尿素酶、D-山梨醇、酚红、帕拉金糖及α-半乳酸苷酶等呈阳性，而对葡萄糖苷酶、麦芽糖、赖氨酸脱羧酶、肌醇、尿素及水杨酸等的利用呈阴性，鉴定百分率为99.9%，100%T（期望值）为0.88，无不符试验，即Bio Mereux ID 32 GN革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒鉴定结果良好。

Biolog微生物自动鉴定系统的3个重要参数为可能性（PROB）、相似性（SIM）和位距（DIST）。其中，SIM和DIST表示测试结果与数据库相应数据的匹配程度。当SIM<5.0，DIST>0.75为良好的匹配;SIM越接近于1.0，即鉴定结果的可靠性越高。本研究的Biolog微生物自动鉴定参数为：PROB=0.994，SIM=0.760，DIST=4.259，即分离菌株180803bj_jzl为弗氏柠檬酸杆菌的可能性高达99.4%。具体的反应项目及鉴定结果见图3。

2. 3 病原菌的分子生物学鉴定结果

以分离菌株180803bj_jzl的DNA为模板，进行16S rRNA序列和gyrB基因PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到1500和1100 bp左右的清晰目的条带（图4）。将扩增获得的16S rRNA序列和gyrB基因在GenBank中进行BLAST同源搜索，分别选取11和10条相似性较高的菌种序列，采用MEGA 6.0中的邻接法构建系统发育进化树。基于16S rRNA序列相似性构建的系统发育进化树显示，分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌和杨氏柠檬酸杆菌（C. youngae）聚类为一支（图5）;基于gyrB基因序列相似性构建的系统发育进化树显示，分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类为一支（图6）。分离菌株180803bj_jzl与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上，gyrB基因序列相似性则在91.00%以上（表2）。

2. 4 人工回归感染试验及病理组织学观察结果

经1×108 CFU/mL菌悬液浸泡感染的加州鲈在浸泡16 h后出现死亡，浸泡第2 d出现的死亡数量明显增加，连续观察7 d发现其累积死亡率达60%。死亡加州鲈的症状与自然发病加州鲈的症状基本相同（图7），且从人工感染发病加州鲈的体内再次分离获得相同的分离菌株。对照组加州鲈在整个试验期间无任何症状，也未发生死亡现象。

人工回归感染发病加州鲈的肝脏中央静脉和肝窦有红细胞淤积;肝板排列紊乱，肝细胞质内有大量空泡，界限不清晰，有些肝细胞核溶解，呈散在变性坏死;狄氏间隙增宽，细胞萎缩、排列疏松，空隙明显增大（图8）。脾脏的白髓与红髓分界不清，脾索增厚，脾索中免疫细胞增多;脾窦和脾小血管内嗜铁血细胞聚集成嗜铁血红素中心;脾窦内皮细胞受损，血管壁水肿，通透性增强（图9）。鳃小片上皮细胞与毛细血管分离，其间充满水肿液，呈球拍状，部分上皮细胞坏死脱落;严重者整个鳃小片细胞坏死、脱落，只残存少量鳃小片骨架（图10）。

2. 5 病原菌的药敏试验结果

由表3可看出，分离菌株180803bj_jzl对氟罗沙星（Fleroxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、大观霉素（Spectinomycin）、新霉素（Neomycin）、庆大霉素（Gentamicin）、恩诺沙星（Enrofloxacin）和诺氟沙星（Norfloxacin）等7种抗菌药物敏感;对多西环素（Doxycycline）、四环素（Tetracyclines）、乙酰螺旋霉素（Acetylspiramycin）、罗红霉素（Roxithromycin）、头孢氨苄（Cefalexin）、阿莫西林（Amoxicillin）、青霉素（Benzylpenicillin）、氨苄西林（Ampicillin）、万古霉素（Vancomycin）、复方新诺明（Cotrimoxazole）、磺胺异噁唑（Sulfisoxazole）、氯霉素（Chloroamphenicol）、氟苯尼考（Florfenicol）、利福平（Rifampin）和林可霉素（Lincomycin）等15种抗菌药物已产生耐药性。

3 讨论

本研究从发病濒死加州鲈肝脏中分离获得1株纯化细菌（180803bj_jzl），其细菌形态学观察为周鞭毛的革兰氏阴性杆菌;ATB Expression生化鉴定仪结果显示为弗氏柠檬酸杆菌，鉴定百分率为99.9%，100%T（期望值）为0.88，无不符试验，鉴定结果良好;Biolog微生物自动鉴定参数为：PROB=0.994，SIM=0.760，DIST=4.259，即分离菌株180803bj_jzl为弗氏柠檬酸杆菌的可能性高达99.4%;再分别基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性构建系统发育进化树，结果显示分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类在同一分支上，与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上，gyrB基因序列相似性则在91.00%以上。综合分离菌株180803bj_jzl的形态学、生理生化特性及分子生物学鉴定结果，可确定该分离菌株为弗氏柠檬酸杆菌。

弗氏柠檬酸杆菌是人类和动物（哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类）肠道内的正常菌群，起初认为是肠道条件致病菌，但近年来发现其强毒菌株可穿过肠道黏膜向全身扩散，引起动物败血症或急性死亡（薛巧等，2015）。本研究通过人工回归感染试验，发现分离菌株180803bj_jzl可致使加州鲈体表局部出血、溃烂，鳃组织充血，肝脏充血、脾脏肿大，与自然发病的临床症状相似，且可再次分离出相同的菌株，说明分离菌株180803bj_jzl具有较强的致病作用。病理组织学观察也显示，分离菌株180803bj_jzl可致机体组织细胞发生明显的病理变化，造成肝脏中央静脉和肝窦扩张淤血，提示淤血区局部血液流动缓慢、缺氧，氧合血红蛋白减少，致使氧气和营养物质供应不足，肝细胞物质代谢与交换受阻，故肝细胞变性坏死，进而造成肝脏代谢紊乱及其解毒功能降低，致使机体代谢障碍，加速鱼体死亡。鳃小片上皮细胞与毛细血管分离，呈球拍状，可能是弗氏柠檬酸杆菌破坏了鳃组织内的磷酸基转移网络，鳃细胞的生物能稳态被破坏，细胞自身生理代谢紊乱，鳃小片上细胞脱离血管网（Baldissera et al.，2018）。球拍状的鳃小片促使上皮细胞与微血管剥离，血液交换功能受阻，上皮细胞营养供应不足，从而导致部分上皮细胞变性，严重者整个鳃小片细胞坏死、脱落，仅残存少量鳃小片骨架鳃，致使呼吸功能和排泄功能受阻，其内环境稳态损坏造成鱼体病变逐渐加重，加速鱼体死亡。

弗氏柠檬酸杆菌的药敏特性随用药时间的推移而发生变化，也因宿主不同而异（沈锦玉等，2005;田飞焱等，2013;卢君辉等，2015;苏英等，2019），对氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物敏感，对四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类抗生素和青霉素类等抗菌药物已产生不同程度的耐药性。本研究的药敏感试验结果显示，分离菌株180803bj_jzl对庆大霉素、诺氟沙星和氧氟沙星敏感，与杨移斌等（2013）、卢君辉等（2015）、肖宁等（2016）的研究报道一致，但对氟苯尼考和磺胺甲恶唑等抗菌药物的敏感性与杨方园等（2013）、张冬星等（2016）、白杰等（2019）的研究结果存在差异，可能与各地的养殖环境、细菌寄主及所处地域的用药习惯不同有关（石征宇等，2018）。因此，在养殖过程中若发生细菌性病害应及时进行病原分离鉴定和药敏试验，筛选出敏感药物，为准确有效地进行科学防治提供科学依据。

弗氏柠檬酸杆菌对氟苯尼考和磺胺甲恶唑等抗菌药物呈逐步向耐药转化的变化趋势（张冬星等，2016;白杰等，2019），且已出现多重耐药性（毛烁君等，2015;肖宁等，2016;石征宇等，2018）。致病菌进化是其自身基因变异与自然环境选择相互作用的结果，耐药株的出现是在抗生素选择压力下发生多位点突变所致（Roumagnac et al.，2006）。当前的养殖过程中仅考虑疾病治愈效果，尚缺乏用药科学依据而滥用抗菌药物，为细菌耐药性变异提供了生态环境的选择压力（杨瑞馥，2009）。也有研究发现，细菌可先进化出休眠能力（耐受性），通过进入暂时休眠而免受抗菌药物的抑菌作用;且细菌获得休眠的能力可快速进化获得耐药性突变，从而抵制抗菌药物的抑菌作用（Levin-Reisman et al.，2017）。养殖过程中长期频繁使用或滥用抗菌药物，致使病原菌長期暴露于含抗菌药物的生长环境下，而促进细菌快速进化（de Lencastre et al.，2007;Baldissera et al.，2018），故推测这类细菌的耐药性还会继续增强。因此，在实际生产中需保持水体环境稳定，减少鱼体应激，同时大力发展绿色养殖模式并加速研制抗菌药物替代物，以确保水产养殖业的可持续健康发展。

4 結论

弗氏柠檬酸杆菌感染可引起加州鲈体表出血和溃疡，且具有较强的毒力，致使肝脏、脾脏和鳃等组织病理损伤，实际生产中可选用新霉素、恩诺沙星等渔用抗菌药物进行防治。

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（責任编辑 兰宗宝）