小熊猫源犬瘟热病毒株H、F基因的克隆及序列分析

蒋 梅，陈 武，翟俊琼，卜婉迪，谢逸伦，刘灿彬，单 芬*,罗满林*

(1.华南农业大学兽医学院，广州 510642； 2.广州动物园 广州市野生动物研究中心，广州 510070)

犬瘟热(cannine distermper, CD)由犬瘟热病毒(canine distermper virus, CDV)感染引起的高度接触性、致病性传染病，呈世界范围内广泛分布[1]。临床症状主要有发热、咳嗽、腹泻、呼吸困难、呕吐甚至死亡[2-3]。CDV是一种有包膜、不分节段、无重叠的单链负股RNA病毒，属于副黏病毒科(Paramyxoviride)，麻疹病毒属(Morbillivirus)[4]。病毒基因组全长为15 690 bp，从3′到5′分别编码核衣壳(N)、磷蛋白(P)(包含两个非结构蛋白基因，C和V)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)8个蛋白[5]。H和F糖蛋白是病毒粒子诱导中和保护性抗体的最外层蛋白质，比其他CDV蛋白更易变异，并决定病毒感染的宿主特异性[6]。两种糖蛋白都是诱导针对CDV的保护性免疫反应的抗原决定簇，H和F基因的遗传变异被认为是宿主感染CDV数量增加的重要原因，因此对CDV毒株H、F基因进行深入研究更为重要[7-8]。

小熊猫(Ailurusfulgens)，国家二级保护动物，目前多被圈养于动物园或野生动物救护站[9]。犬瘟热病毒已经成为我国圈养小熊猫大量死亡、种群数量急剧下降的主要病原，常与犬冠状病毒、犬细小病毒发生混合感染，危害严重[10-11]。1968年，米克维茨[12]首次报道犬瘟热病毒导致小熊猫的大规模疾病和死亡，随后，中国多地相继报道圈养小熊猫感染犬瘟热病毒的病例，包括因接种犬瘟热弱毒疫苗导致死亡的案例等[13]。本研究中的毒株来自江苏某地封闭管养圈养的小熊猫，此前从未发生过犬瘟热感染，所以，探究病毒的遗传演化背景，了解病毒基因的变异情况对疾病防控具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料、菌株 病料采集自江苏某地感染犬瘟热病毒病死小熊猫的肺组织；大肠杆菌DH5α感受态购自天根生化(北京)科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自AXYGEN生物技术有限公司产品；胶回收试剂盒，购自OMEGA公司产品；DNA Marker、pMD18-T 载体，PrimerScriptTMOne step RT-PCR Kit，均购自宝生物(大连)有限公司；氨苄青霉素(Amp+)、LB培养基(酵母提取物2 g、胰蛋白胨1 g和氯化钠2 g，定容至200 mL)均购自广州华奇盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 病料组织置于4倍体积的PBS中进行充分研磨，分装后4 ℃ 5 000 r·min-1离心10 min，弃沉淀，收取的上清液用0.22 μm滤器过滤除菌，保存于-80 ℃备用。

1.2.2 基因克隆及测序 比较分析GenBank上发表的犬瘟热病毒N基因序列，设计合成用于鉴定感染CDV的特异性鉴定引物，比较分析GenBank上发表的H、F基因全长序列，设计扩增H及F基因的引物，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，引物详细情况见表1。扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与pMD18-T 载体连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞，初步鉴定正确的重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 扩增CDV的引物设计

1.2.3 序列分析 采用Lasergene Version 7.1 软件中SeqMan、Meglign的对序列进行拼接、序列比对、抗原表位及分子特征分析。测得的序列登陆NCBI进行BLAST分析。同时下载不同基因型的犬瘟热病毒代表序列进行基因、氨基酸序列相似性分析。采用MEGA7.1软件绘制H、F基因的系统进化树。进化树的绘制方法：应用Neighbor-joining法(参数设置为1 000 replications)及Maximum composite likelihood model 比对核苷酸序列。采用NetNGlyc1.0软件进行糖基化位点分析。

2 结 果

2.1 鉴定引物RT-PCR扩增及H、F全长基因扩增

采用针对CDVN基因的特异性鉴定引物经RT-PCR 扩增、1%琼脂糖凝胶电泳之后，得到大小约为637 bp的目的基因片段，结果与预期片段大小一致(图略)，将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，比对分析证实为CDVN基因序列。采用针对H、F基因全长的特异性引物，对H、F的全长基因进行扩增，产物经1%琼脂糖凝胶检测，获得与预期大小一致的H基因全长片段(1 824 bp)和F基因全长片段(1 989 bp)，结果如图1所示。

A. GD-1 H基因扩增；B. GD-1 F基因扩增；M. DL5000 DNA相对分子质量标准；1. 阴性对照；2. 扩增片段；3. 阳性对照

2.2 H、F基因的序列及遗传演化分析

H基因序列测定结果表明：H基因全长为1 824 bp， 编码607个氨基酸。登录GenBank进行Blast分析，H基因序列与丹麦报道的登录号为GU266280犬源犬瘟热病毒株的核苷酸序列相似性最高，为96%。与其他参考毒株的核苷酸相似性为88.5%～95.4%，相应的氨基酸序列相似性为83.1%～95.2%，与标准强毒株A75/17(登录号:AF164967，犬源CDV)氨基酸相似性为95.2%；与Convac、Onderstepoort、Recombinant Snyder Hill、CDV3四种经典疫苗株同源性较低，核苷酸相似性为90.3%～90.8%，对应的氨基酸序列相似性为88.2%～89.3%。

F基因测序结果表明，F基因全长为1 989 bp，编码663个氨基酸，其中1—135位是信号肽，136—224位为F2，225—662位为F1，切割位点的氨基酸序列为A↓QIHW。登录GenBank进行Blast分析，与巴西报道的登录号KY057355犬源犬瘟热病毒的核苷酸相似性最高，为95.7%；与其他CDV毒株相应的基因序列核苷酸相似性为92.2%～95.6%，其推定的氨基酸相似性为91.1%～99.0%，与疫苗株Onderstepoort、Recombinant Snyder Hill、CDV3、Shusiky等相应序列的核苷酸、氨基酸序列相似性较低，分别为91.0%～91.2%和89.1%～89.7%。

应用MEGA 7.0软件将GD-1株H、F基因与Asia-1、Asia-2、Asia-3、Asia-4、America-1、America-2、Europe、Europe-wildlife、Rockborn-like和Arctic-like等10个基因型的参考毒株进行遗传演化分析。结果发现：GD-1株分离株与Asia-4型的各参考毒株亲缘关系较近，位于同一大的进化分支，但是单独形成一个小的亚基因型分支，而与疫苗株America-1 亲缘关系远，这与国内报道的流行毒株位于Asia-1型存在差异(图2)。

2.3 H、F基因的分子特征分析

对H、F蛋白基因进行N-糖基化位点分析，结果显示：H蛋白基因具有8个N-糖基化位点，分别在19、149、309、391、422、456、587、603位点。其中，309—311糖基化位点是野毒株所特有的；其他位点没有发现新增的糖基化位点，这和大量文献中报道的野毒株含有8个或9个糖基化位点相一致；F蛋白共有6个N-糖基化位点，分别位于62、108、141、173、179、517位。

对H、F基因编码氨基酸序列进行蛋白抗原表位预测，H蛋白的抗原表位在1—38、368—391、419—433、568—607位氨基酸，与CDV3、Convac、recombinant Snyder Hill和Onderstepoort 疫苗株存在差异，与疫苗株Convac株、Onderstepoort株在393—408位氨基酸的抗原表位也有不同，与经典野毒株A75/17比对，在419—450、568—607位氨基酸处有较大差异。对F基因编码的F0蛋白进行抗原表位预测比对分析，在1—133、176—194、629—663位氨基酸的抗原表位与疫苗株(CDV3株、Shusiky株、recombinant Snyder Hill株和Onderstepoort株)和经典野毒株A75/17相应区域差异明显。

CDV H蛋白作为重要的膜蛋白，主要通过与宿主体内SLAM受体结合而复制。研究表明H蛋白个别氨基酸位点改变会影响与SLAM受体的结合能力。文献报道这些位点集中在525、526、529、530、549等，分析发现本分离株的这几个位点氨基酸与欧亚野生毒株的完全一致，与疫苗株相比530、549位氨基酸差异明显。

此外CDV H及F蛋白单个氨基酸的变异，可能引起毒力发生改变。分析发现该毒株的H蛋白氨基酸序列与其他CDV参考毒株相比，在24、41、85、219等共计9个氨基酸位点发生明显变异(表2)。与其他参考毒株相比， F蛋白共计有115、130、162等11处氨基酸发生了新的变异(表2)。

表2 分离株H、F蛋白氨基酸变异位点分析

3 讨 论

CDV作为引起小熊猫大批量死亡、数量骤减的重要病原之一，其导致的CD暴发具有发病急、传播快、发病率高、死亡率高等特点[14-15]。近年来，各地不断有圈养野生动物感染CDV的报道，如1991—1992年北美动物园的虎、豹等，1994年坦桑尼亚塞伦盖蒂国家公园的狮子，1997年中国重庆动物园的大熊猫、2004年俄罗斯博克罗夫卡的西伯利亚虎，中国广西人工饲养场恒河猴等[16-21]。CDV的宿主范围也越来越广，由传统宿主犬科、浣熊科、鼬科动物扩大至食肉目所有8个科的动物，给疾病的预防增加了难度[22-24]。本研究中的小熊猫，此前未接种过相关疫苗，且长期封闭圈养，排除疫苗免疫造成的感染，更大可能性来自于野毒感染，病例发生之前有针对小熊猫分型研究的团队在该地进行过采样，据了解，研究人员此前的采样地是成都某小熊猫圈养地，而此地此前就发生过小熊猫感染CDV的病例，究竟两地之间的病例是否存在关联还在进一步研究中。

本分离株的H蛋白具有8个潜在糖基化位点(19、149、309、391、422、456、587、603)，包含野毒株所特有的309—311糖基化位点，未发现新增的糖基化位点，这与大量文献中报道的野毒株含有8或9个糖基化位点相一致，与当前流行的Asia-4型的CDV一致。根据H、F抗原表位分析，GD-1株的抗原表位与疫苗株的相应序列存在较大差异，蛋白抗原决定簇发生改变，暗示更多免疫逃避株的存在。与各参考毒株相比，该株H、F蛋白还存在不同数量的氨基酸位点变异，这些关键位点氨基酸的变异，是否影响了病毒本身传播能力或毒力还有待进一步研究。

基于犬瘟热病毒的地域流行情况，目前已报道过约17个基因型[25-29]，分别称为亚洲1～4型、美国1型(多为疫苗株)、美国2～5型、欧洲1型(南美洲1型)、欧洲野生动物型、南美洲2型、南美洲3型、北极型、类洛克伯恩型、非洲1型、非洲2型等。构建基于F、H基因进化树，GD-1株在基因型判定为Asia-4，但是与Asia-4的毒株基因序列仍存在差异，隶属小的进化分支。与当前我国流行的Asia-1型各野毒株亲缘关系较远，之前本研究团队报道过广东某地分离小熊猫源CDV，均属于Asia-1型[30-31]。据Piewbang等[26]近年的报道，Asia-4基因型主要在泰国地区呈流行趋势，宿主源主要是犬、果子狸以及新报道的麝香猫等。本研究结果提示在高强度的疫苗免疫之下，国内犬瘟热病毒免疫逃避株越来越多，病毒本身发生更多漂移或漂变，而关于本研究中毒株的传播能力、致病机制等有待进一步研究。

4 结 论

本研究在国内首次报道了位于Asia-4的小熊猫源CDV，并对病毒的H、F 蛋白进行系统分析，在目前缺乏野生动物专用犬瘟热疫苗使用的情况下，了解新流行毒株的分子特点及变异情况、对于圈养野生动物犬瘟热的科学防控具有指导意义。