硫化氢暴露不同时长对断奶仔猪生长性能、血液指标及组织病理学的影响

谢彦娇，刘 真，陈 磊，苗启翔，张宏福，唐湘方

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

随着畜禽养殖业向规模化、集约化方向的快速发展，畜禽舍内有害气体对畜禽和人类健康存在的直接伤害和潜在威胁，愈加受到关注。氨气(NH3)、硫化氢(H2S)和二氧化碳(CO2)是畜禽舍内的主要有害气体[1]。养殖场的硫化氢主要是由废弃物中的细菌在无氧条件下由含硫有机物酵解而成[2]，而含硫有机物主要存在于畜禽的粪便、饲料残渣以及垫料中[3]。另一方面，当供给的饲料中蛋白质成分较高时，机体的消化机能发生紊乱，畜禽肠道中会排出大量的硫化氢，导致舍内硫化氢含量升高[4]。国家标准《规模猪场环境参数及环境管理》(GB/T 17824.3—2008)将哺乳猪舍、保育猪舍硫化氢浓度上限定为8 mg·m-3，其他阶段猪舍定为10 mg·m-3。 美国职业安全与健康管理局(OSHA)规定硫化氢的8 h暴露上限为15 mg·m-3，而美国国家职业安全与健康研究所(NIOSH)规定，硫化氢10 min暴露浓度限值为15 mg·m-3。目前，国内外规模化猪场硫化氢浓度大多数在3 mg·m-3以下[5-8]，但受到猪舍通风、粪便处理等因素影响，仍有猪舍硫化氢浓度出现超标的报道[9-10]。硫化氢具有刺激性气味，作为一种广谱有毒有害气体，对人和动物的眼睛、呼吸道、神经系统等多个器官组织均会产生不利影响。研究表明，硫化氢暴露使得肉鸡体内氧化应激平衡状态遭到破坏，引发炎症反应，导致心、肝以及肺等脏器出现病理损伤[11-16]。本课题组前期研究[17]也发现，断奶仔猪暴露在硫化氢浓度为30 mg·m-3时，肺部出现炎症反应。陈小风等[18]研究表明，硫化氢浓度高于10 mg·m-3时，会导致断奶仔猪的生长性能下降，免疫受损且引发机体的炎症反应。赵天[19]研究表明，16 mg·m-3硫化氢暴露可引起肉羊应激，在一定程度上降低肉羊生长性能、免疫功能和抗氧化能力。目前，国内外关于硫化氢暴露对动物的影响，多以鼠、肉鸡以及肉羊为模型，而以猪为模型的系统性研究较少，而有关硫化氢暴露不同时长对断奶仔猪生长及健康的影响研究尚未见报道。因此，本研究以GB/T 17824.3—2008、NIOSH和OSHA规定的暴露浓度最高限值15 mg·m-3为试验组，探究在硫化氢暴露浓度最高限值条件下，不同时长对断奶仔猪生长性能、血液生理生化指标以及主要呼吸、循环、代谢和免疫器官健康的影响，为畜禽舍硫化氢中毒早期预警及环境舒适度评价提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试验设计

试验采用单因子试验设计，选取12头平均体重为(11.25±0.69)kg的健康断奶仔猪(大白猪)，随机分配到2个环控舱，公母各半，试验组环控舱内硫化氢浓度设置为15 mg·m-3(硫化氢暴露组)，对照组环控舱不给予硫化氢，实测硫化氢浓度为0 mg·m-3(对照组)。每个舱为一个处理组，每个处理组设6个 重复，每个重复1头猪。试验期28 d。

1.2 试验饲粮

试验采用玉米-豆粕型日粮作为基础饲粮，所选用配方满足中国猪饲养标准(2004)营养需要量。其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 饲养管理

1.4 样品采集与保存

硫化氢暴露2、14和28 d后，采用真空采血管对每头猪进行颈静脉采血，每头仔猪采集2份血液样本，每份10 mL，一份用于血液常规指标测定，另一份用于制备血清。制备血清时，将采血管放入转速为3 000 r·min-1的离心机中分离，离心10 min中后取出，用移液枪将血清分别装在离心管中，做好标记后放在-80 ℃冰箱保存。硫化氢暴露28 d后，对仔猪电击致晕后屠宰，并采集气管、肺、肝、心、肾、脾和胸腺。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 生长性能测定 在试验开始前和结束后对所有断奶仔猪进行空腹称重，用于计算平均日增重(ADG)。试验期间，每日记录舱内断奶仔猪采食量，用于计算平均日采食量(ADFI)。根据平均日增重和平均日采食量计算料重比(F/G)。

1.5.2 血常规指标测定 采用全自动血液分析仪(中国优利特，TEK-II mini)测定血液常规指标，主要包括白细胞总数(WBC)、淋巴细胞百分比(LYM%)、中间细胞百分比(MID%)、粒细胞百分比(GRA%)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞宽度变异系数(RDW-CV)、血小板总数(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)和血小板分布宽度(PDW)。

1.5.3 血清生化指标检测 采用生化自动分析工作站(美国贝克曼库尔特，DxC 600型)测定血清生化指标。肝功能相关指标：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)和碱性磷酸酶(ALP)；肾功能相关指标：尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)；心功能相关指标：肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)和乳酸脱氢酶(LDH)；免疫相关指标：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)。此外，与免疫相关的C反应蛋白(CRP)采用酶联免疫法测定，所用试剂盒购自北京亿鸣复兴生物公司。

1.5.4 病理组织学检查 解剖仔猪后迅速分离气管、肺、肝、心、肾、脾、胸腺，固定在4%多聚甲醛中，24 h后，取各组织用乙醇脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(H.E.)染色。切片用中性树脂封闭。采用全自动数字玻片扫描仪(Pannorama MIDI，3D HISTECH，匈牙利)观察标本的组织学变化。

1.5.5 脏器称重及脏器指数 同一标准下，取肺、肝、心、肾、脾、胸腺，去除结缔组织，吸水纸吸干表面的血液后称重，计算脏器指数。脏器指数=(脏器重量/仔猪宰前体重)×100%。

1.6 数据处理及统计分析

采用SPSS 21.0软件，将初重作为协变量，对生长性能数据进行协方差分析，以消除试验仔猪初重的影响，结果以“平均值±标准误”表示。其余数据采用SPSS 21.0软件的Compare Means模块的T Test程序进行T-test检验，结果以“平均值±标准误”表示。以P<0.05和P<0.01分别作为差异显著和极显著性的判别标准。

2 结 果

2.1 硫化氢暴露对断奶仔猪生长性能的影响

由表2可知，硫化氢暴露28 d后，与对照组相比，试验组仔猪中ADG、ADFI和F/G无显著性差异(P>0.05)。但ADG和ADFI分别降低了13.25%和14.27%，F/G增加了12.78%。

首先，消费者应实时了解国家相关政策，以便知晓和维护自己的合法权益。问卷调查结果显示，消费者对政策的变动普遍关注度较低，然而，消费者的这种心理一方面会或多或少的对消费者自身长期利益造成损害，一方面也不利于政策的有效推行和政府的有力管控。

表2 硫化氢暴露对断奶仔猪生产性能的影响

2.2 不同时间硫化氢暴露对断奶仔猪血常规指标的影响

由表3可知，硫化氢暴露2 d，与对照组相比，试验组仔猪血液中MCV、PCT、MPV、PDW显著升高(P<0.05)，MCHC显著降低(P<0.05)，其余指标无显著性差异(P>0.05)；暴露14 d，与对照组相比，试验组仔猪血液中LYM%、MCH显著升高(P<0.05)，RBC显著降低(P<0.05)，其余指标无显著性差异(P>0.05)；暴露28 d，与对照组相比，试验组仔猪血液中GRA%、HGB、MCH、PDW显著升高(P<0.05)，PLT、PCT显著降低(P<0.05)，其余指标无显著性差异(P>0.05)。

表3 不同时间硫化氢暴露对断奶仔猪血液常规指标的影响

2.3 不同时间硫化氢暴露对断奶仔猪血液生化指标的影响

2.3.1 血清中肝功能相关生化指标 由表4可知，硫化氢暴露2 d，与对照组相比，试验组仔猪血清中TP、ALT和TBIL显著升高(P<0.05)，其余指标无显著性差异(P>0.05)；暴露14、28 d，与对照组相比，试验组仔猪血清中肝功能相关的生化指标均无显著性差异(P>0.05)。

表4 不同时间硫化氢暴露对断奶仔猪血清中肝功能相关生化指标的影响

2.3.2 血清中肾功能相关生化指标 由表5可知，硫化氢暴露2、14、28 d，与对照组相比，试验组仔猪血清中肾功能相关生化指标无显著性差异(P>0.05)。

表5 不同时间硫化氢暴露对断奶仔猪血清肾功能相关生化指标的影响

2.3.3 血清中心功能相关生化指标 由表6可知，硫化氢暴露2 d，与对照组相比，试验组仔猪血清中CK显著升高(P<0.05)，其余各项指标无显著性差异(P>0.05)；暴露14、28 d，与对照组相比，试验组仔猪血清中心功能相关生化指标均无显著性差异(P>0.05)。

表6 不同时间硫化氢暴露对断奶仔猪血清心功能相关生化指标的影响

2.3.4 血清中免疫相关指标 由表7可知，硫化氢暴露2 d，与对照组相比，试验组仔猪血清中IgA显著升高(P<0.05)，其余各项指标无显著性差异(P>0.05)；暴露14 d，与对照组相比，试验组仔猪血清中各项指标无显著性差异(P>0.05)；暴露28 d， 与对照组相比，试验组仔猪血清中IgA、IgM、CRP显著升高(P<0.05)，其余各项指标无显著性差异(P>0.05)。

表7 不同时间硫化氢暴露对断奶仔猪血清中免疫相关指标的影响

2.4 硫化氢暴露对断奶仔猪脏器指数的影响

由表8可知，硫化氢暴露28 d，与对照组相比，试验组中肺、肝、心、肾、脾以及胸腺的脏器指数均无显著性变化(P>0.05)。

表8 硫化氢暴露对断奶仔猪脏器指数的影响

2.5 断奶仔猪硫化氢暴露后组织病理学观察结果

由图1可知，对照组中肺的组织结构完整，小叶结构清晰，肺泡结构完整，肺泡腔无异物。硫化氢暴露组中，肺组织结构完整，肺小叶间隔清晰，肺实质内可见部分区域肺泡壁有充血现象(蓝色箭头)，实质内有较小的炎性灶(红色箭头)，以淋巴样细胞为主，肺泡隔增厚。试验组气管较对照组无病理性差异，结构完整，黏膜下层和固有层腺体较丰富，黏膜上皮中假复层纤毛柱状上皮结构完整，纤毛结构清晰。试验组心组织较对照组无病理性差异，可见心肌纤维无明显异常，呈柱状排列，肌丝明显，心肌细胞细胞核呈卵圆形，细胞核位于中央。试验组肝组织较对照组无病理性差异，肝基本结构完整，肝小叶结构清晰，肝细胞呈梭状排列成肝板，门管区由小叶间动静脉及小叶间胆管组成。试验组肾组织较对照组无病理性差异，皮质结构中肾小球包裹在肾小囊中，肾小囊腔未见异物，由单层立方上皮围成的肾小管围绕在周围。试验组脾组织较对照组无病理性差异，基本结构完整，实质内红白髓结构清晰。试验组胸腺较对照组无病理性差异，被膜结缔组织深入内部形成大小不同的小叶分隔，皮质深蓝染，细胞密集，髓质染色较淡。

(续图1 Continued)

A. 对照组；B. 试验组。蓝色箭头表示肺泡壁有充血现象，红色箭头表示肺实质内有较小的炎性灶

3 讨 论

3.1 硫化氢暴露对断奶仔猪生长性能的影响

适宜的环境对动物的生长发育至关重要。当畜禽舍内有害气体浓度较高时，会引发机体的应激反应，降低动物食欲，从而抑制体重增长速度，影响正常的生长发育[20]。Dorman等[21]将Fischer-344大鼠、Sprague-Dawley大鼠和B6C3F1小鼠暴露于0、10、30和80 mg·kg-1硫化氢90 d后，发现高浓度硫化氢组(80 mg·kg-1)鼠在整个试验过程中采食量显著下降，最终体重与对照组相比也下降。但是，Gagnaire等[22]将Sprague-Dawley大鼠暴露在75 mg·m-3硫化氢中25周，每周5 d，发现硫化氢暴露并未对体重增长造成显著影响。Wang等[23]研究发现，0～3周肉鸡分别暴露在2、4和8 mg·kg-1硫化氢中，8 mg·kg-1硫化氢处理组日增重和日采食量分别显著降低13.0%和25.02%；4～6周肉鸡分别暴露在3、6和12 mg·kg-1硫化氢中，日增重和饲料转化效率均不受硫化氢浓度的影响，但随着硫化氢浓度的增加，日增重和饲料效率均呈下降趋势。Curtis等[24]报道，杂交猪暴露于13 mg·m-3硫化氢中17 d，体重无显著性变化。陈小风[25]研究发现，断奶仔猪暴露在0、5、10、15 mg·m-3硫化氢中，日增重和日采食量显著降低，料重比显著升高。由此可见，不同浓度硫化氢暴露对不同物种的生长性能可能会造成一定的负面影响，以上不尽相同的试验结果，可能和不同试验物种、硫化氢浓度以及暴露时间有关。本试验结果与前人研究结果不尽一致，断奶仔猪暴露在15 mg·m-3的硫化氢中28 d后，ADG、ADFI和F/G均无显著性变化，但日增重和日采食量仍有下降的趋势。出现这一结果的原因可能是，硫化氢对断奶仔猪生长性能的影响受到浓度和时间的双重影响，在以后的试验设计中值得进一步研究。

3.2 硫化氢暴露对断奶仔猪血常规指标的影响

当外界环境发生变化时，动物机体会做出相应的调节，导致血液成分的改变以及一系列的代谢调整[26]。WBC是一类具有防御和免疫功能的细胞，其数量变化反映了机体的免疫状态[27]。LYM是具有免疫识别功能的细胞系，是机体免疫应答功能的重要细胞成分[28]。GRA是机体最为丰富的免疫细胞，受到炎症刺激后增加[29]。赵天[19]研究发现，在整个试验期内，高浓度H2S暴露组(16 mg·m-3)肉羊LYM极显著增加，表明肉羊产生应激，发生了炎症反应。本试验中，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢中暴露2 d后，血液中LYM%和GRA%均未发生显著变化，而暴露14 d，后血液中LYM%显著升高，暴露28 d后血液中GRA%显著升高。这些结果提示，短期硫化氢暴露对血液白细胞系统不会造成较大影响，随着暴露时间的延长，血液白细胞系统被激活，机体的免疫细胞做出相应的免疫应答，断奶仔猪机体可能发生炎症反应。

PLT具有原始炎症细胞的特性，有参与止血和炎症反应的双重功能[30]。PCT的变化与PLT的数量有关，PDW可以反映血小板容积大小的离散度。Dorman等[21]研究发现，Fischer-344雌性大鼠暴露在120 mg·m-3硫化氢中，PLT增加，但只有很小的比例(6%)。本研究中，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢中暴露2 d后，PCT、MPV和PDW均显著升高；暴露28 d后，PLT和PCT显著降低，PDW显著升高。这些结果表明，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢暴露下，短时间内血小板系统被激活，调节免疫应答和炎症反应，但是随着暴露时间的延长，机体炎症反应积累，导致血液中血小板数量减少。

红细胞主要参与动物体内氧气、二氧化碳以及营养物质的运输[31]。本研究发现，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢中暴露2 d时，MCV显著升高，MCHC显著降低，说明外周血红细胞大小间差异变大。当MCH高于正常范围时，可能是由于动物机体内促进红细胞成熟物质缺乏导致贫血[32]。贫血可能会引起RBC的减少，血液中RBC是反映机体营养状况的重要指标。本研究发现，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢中暴露14 d后，MCH显著升高，RBC显著降低，说明仔猪的营养状况可能受到影响，出现贫血症状；暴露28 d后，血液中HGB和MCH显著升高，可能是因为硫化氢可与HGB结合形成硫血红蛋白，硫血红蛋白的形成降低了HGB对氧气的亲和力，抑制了氧气的运输[33]。说明随着硫化氢暴露时间的延长，可能会导致断奶仔猪体内氧气供应不足，需要增加血红蛋白的含量提高血液运输氧气的能力。

3.3 硫化氢暴露对断奶仔猪心、肝和肾功能的影响

血液生化指标具有相对的稳定性，其变动提示动物机体新陈代谢以及生理病理变化，是机体器官病变的信号，间接反映机体的健康状况[34]。肝是蛋白质和多种酶合成代谢的主要场所，肝受损时，多种血液生化指标会发生改变[35]，其中，血液中TP和ALB的含量能够反映肝的蛋白合成能力。ALT和AST是反应肝功能的常见敏感指标[36]，TBIL是动物机体内铁卟啉化合物的主要代谢产物，是反映肝代谢功能的另一重要指标。血液中的BUN和CREA主要通过肾排除体外，是反映肾功能的重要指标[37]。CK和LDH是反应心肌损伤的敏感生化指标[38]。环境因子的变化，往往对动物器官功能和血液生化指标产生不同程度影响。在热应激刺激下，巴马香猪血液中的TP和ALB无显著变化[39]。肉鸡在高氨应激下，血清中ALP、ALT、AST、LDH、CK显著提高[40]，表明氨气对肝功能产生了不良影响。育肥猪在高温应激时，血液中ALT、AST、LDH、CK均显著升高，且与作用时间呈正相关[41]。Stein等[42]试验结果表明，雄性Sprague-Dawley大鼠暴露于120 mg·m-3硫化氢中6 h，再经历室内空气恢复1 h后，血清ALT未发生显著变化，而CK-MB水平升高，表明有轻微的心毒性作用。本研究中，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢暴露2 d后，血清中TP、ALT、TBIL含量显著升高，提示机体肝功能受损。同时，血清中CK含量显著升高，说明心功能可能也受到了一定损伤，出现这种现象的原因可能是，动物应激时，由于能量供应不足、细胞受损、细胞膜的通透性升高，使血液中CK浓度升高[43]。随着硫化氢暴露时间的延长，暴露14和28 d后，断奶仔猪肝、心以及肾相关的血清生化指标均无显著性差异。由此说明，肝和心作为机体物质代谢和能量代谢的中心，具有很强的再生能力和代偿功能，肝和心通过自我修复后，其功能逐渐恢复正常。以上结果表明，15 mg·m-3硫化氢暴露对断奶仔猪肾功能未产生影响，对其肝功能和心功能在短期内造成一定损伤，但随着暴露时间的延长，仔猪对不良环境的适应性增加，器官功能恢复正常。

3.4 硫化氢暴露对断奶仔猪免疫功能相关指标的影响

免疫是机体识别非自身大分子物质，并通过免疫应答排除异物，以维持机体内外环境的平衡与稳定[44]。IgA、IgM和IgG是免疫球蛋白的重要类型，其含量的多少代表机体免疫功能的强弱[45]，且对自身免疫应答和炎症反应具有一定的调节作用。研究表明，暴露在浓度为12 mg·m-3的硫化氢中，肉仔鸡仅有IgG水平会显著下降，IgA和IgM的含量无显著性变化。当硫化氢浓度达到18 mg·m-3时，血清IgA、IgM和IgG均显著下降[46]。陈小风[25]研究发现，硫化氢暴露浓度为15 mg·m-3时，断奶仔猪血清中IgA含量显著降低，而IgG和IgM的含量较对照组均无显著性变化。本研究与前人的研究结果不一致，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢中暴露2 d时，血清IgA的含量显著升高；暴露14 d时，血清IgA、IgM和IgG含量均无显著变化；暴露至28 d时，血清IgA和IgM显著升高。有研究发现，肉鸡暴露于硫化氢中，会导致机体的肺[47]、脾[12]、法氏囊[14]和胸腺[15]等组织器官出现炎症反应，因此，出现这一现象，可能是硫化氢的长期刺激，机体产生炎症反应，导致体内免疫系统平衡遭到破坏，免疫应答被激活，分泌出较多免疫球蛋白。而且，应激强度和持续时间、动物种类以及生理阶段也会对免疫球蛋白的变化产生影响[48]。此外，本研究发现，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢中暴露28 d后，血清中CRP显著上升。CRP是肝产生的一种炎性因子，在炎症反应或者应激状态下，其水平会比较高[49]。综上所述，暴露在浓度为15 mg·m-3的硫化氢中，短时间内可能诱导断奶仔猪产生一定的免疫应答，随着时间积累，机体通过自身免疫调节恢复免疫平衡，而后又可能会导致机体免疫紊乱和炎症反应，影响机体免疫功能。

3.5 硫化氢暴露对断奶仔猪脏器指数及组织病理学的影响

脏器指数在一定程度上能够反映动物器官的发育情况、功能强弱和受损情况[50]。动物体内，气管和肺是主要的呼吸器官，心、肝和肾是主要的循环代谢器官，脾和胸腺是主要的免疫器官。Caveny等[51]研究发现，不同的氨气浓度和不同的作用时间对肉仔鸡法氏囊指数的影响无显著性差异。Dorman等[21]研究发现，Fischer-344大鼠、Sprague-Dawley大鼠和B6C3F1小鼠暴露在120 mg·m-3硫化氢中，对器官指数未产生影响。本试验与前人的关于环境因子暴露研究结果类似，断奶仔猪在15 mg·m-3硫化氢中暴露28 d后，肺、心、肝、肾、脾和胸腺，各器官指数无显著性变化，表明15 mg·m-3H2S暴露对断奶仔猪主要呼吸、循环、代谢及免疫器官的发育没有产生明显影响。

呼吸器官作为气体交换的首要场所，最容易受到硫化氢的影响。Lewis和Copley[52]研究表明，长期吸入低于15 mg·m-3H2S会导致成人和儿童的呼吸系统疾病，包括肺炎、哮喘、慢性支气管炎。Wang等[47]研究发现，H2S通过触发NF-κB途径诱导鸡Th1/Th2失衡，加重脂多糖诱导的肺炎。Liu等[17]研究发现，暴露在30 mg·m-3H2S中，断奶仔猪的肺部出现炎症反应。本研究的组织病理学观察发现，15 mg·m-3H2S暴露组断奶仔猪的肺出现轻微炎症反应，支气管管腔中有数量不等的脱落上皮和炎性细胞，部分区域肺泡周围及结缔组织间有数量不等的炎性细胞浸润。但是，15 mg·m-3H2S暴露组断奶仔猪的气管、肝、心、肾、脾和胸腺的组织切片中尚未发现明显的病理损伤。由此可见，15 mg·m-3H2S暴露28 d可引起断奶仔猪肺轻微的炎性病理损伤，而未对其他器官产生明显病理损伤，但具体的作用机制还需要进一步的研究。

4 结 论

断奶仔猪暴露于15 mg·m-3硫化氢中，短时间内可激活机体免疫应答，肝和心功能可能受到一定损伤，而随着时间延长，各器官发生代偿修复，机体适应能力不断增强，但长时间暴露容易造成肺部损伤，不利于断奶仔猪生长和健康。