桃品种鉴定的SSR 核心引物筛选及其应用*

关利平，王玲玲，曹 珂，王力荣

（中国农业科学院郑州果树研究所，河南 450009）

我国是桃属植物的起源中心，种质资源非常丰富。桃在我国有近5 000 年的栽培历史，各地交流频繁，大多数品种差异不甚明显，造成同物异名、同名异物现象时常发生[1]。因此，迫切需要建立一套快速、准确的桃品种鉴定技术体系，为桃知识产权保护提供技术支撑，这对桃种质资源保存、开发利用及提高育种效率等具有重要的理论意义和应用价值。国际植物新品种保护联盟（UPOV）推荐SSR（simple sequence repeat）和SNP（single nucleotide polymorphism）作为指纹图谱构建的标记方法。其中，SSR 标记由于技术成熟、多态性高、稳定性强及成本低等特点，已对苹果[2]、梨[3]、枣[4]等物种的全基因组SSR 进行了全面的解析。

目前，国内外的学者已经在桃上开展了大量关于SSR 标记开发和指纹图谱构建的研究。如Yoon等[5]从已发表的108 个SSR 位点中筛选出33 个，对96 份桃及油桃进行鉴定；陈昌文等[6]利用BPPCT、UDP 等80 对SSR 引物，对237 份中国桃地方品种、育成品种及其野生近缘种进行鉴定，筛选出8 对引物，使176 份种质具有可分辨的分子身份证；Bouhadida 等[7]筛选出15 对SSR 引物，对94 份桃种质进行扩增，结果表明其中的8 对引物可以有效区分所有种质；Cao 等[8]从桃全基因组上筛选出53 对SSR 引物，对104 份中国桃地方品种进行鉴定；王清明等[9]选用35 对已发表的SSR 引物构建了22 份观赏桃的指纹图谱。虽然上述SSR 标记在桃指纹图谱构建上得到了广泛应用，但按照传统的方法，这些SSR 标记的开发不仅费时、费力、效率低且缺乏统一标准。

随着桃基因组测序完成，使得从全基因组开发SSR 标记成为可能，且基于桃的全基因组重测序数据开发的SSR 标记可能存在更高的多态性。因此，本研究以全基因组重测序获得的SSR 标记为基础，从中筛选出10 对多态性高且重复性好的SSR 标记用于指纹图谱构建和纯度鉴定，为更好地研究和利用这些种质材料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样本采集于中国农业科学院郑州果树研究所国家桃种质资源圃。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取

每个样本采集新鲜幼嫩叶片2 g，用冰袋保存迅速带回实验室，采用CTAB 法提取叶片基因组DNA。

1.2.2 PCR 扩增

PCR 扩增的反应体系为：10×PCR buffer 1 µL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 µL，荧光标记的正反向引物的混合物0.6 µL，DNA 样品（20～30 ng/µL）1 µL，5U Taq DNA 聚合酶0.1 µL，超纯水6.5 µL。

PCR 扩增的反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环。4 ℃保存备用。

1.2.3 PCR 产物检测

等体积混合不同荧光标记扩增产物，混匀后从混合液中吸取1 µL 加入到DNA 分析仪专用的96孔板中，每孔另外加入8.5 µL 去离子甲酰胺和0.5 µL ABI GeneScan 500LIZ分子量内标。将样品在PCR仪上94 ℃变性3 min，将双链变性成单链，迅速取出置于冰上冷却10 min，瞬时离心10 s 后上机检测。

参考机器操作标准，打开DNA 分析仪，检查仪器工作状态。更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板置于样品架基座上。打开数据收集软件。按照仪器操作程序，制作板标，输入样本编号或名称。启动程序，DNA 分析仪自动收集记录毛细管电泳数据。

1.2.4 桃上已发表的SSR 筛选

从前人发表的具有高多态性的SSR引物中筛选出15 对，包括陈昌文等[6]发表的9 对（BPPCT008、CPPCT022、BPPCT017、UDP008、BPPCT020、UDP40、BPPCT034、CPPCT005、UDP409），Yoon 等[5]发表的5 对（CPPCT031、UDP001、BPPCT009、CPPCT003、CPPCT013）和Aranzana 等[10]发表的BPPCT015。

1.3 数据处理与分析

纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y 分别为该位点上2 个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后。用POPGENE32 软件计算每个SSR 位点检测到的等位基因数目（NA）、特异等位基因数目（NPA）、基因多样性（GD）、多样性指数（I）。

2 结果与分析

2.1 15 对SSR 多态性比较

为评价Guan 等[11]基于全基因组重测序筛选的15 对SSR 引物的多态性，利用从已发表文献中筛选出的15 对高多态性SSR 标记，同时对36 份不同种质类型桃品种进行扩增（表1）。将上述2 组SSR标记的多态性进行比较（表2）。结果表明这2 组SSR 标记在供试的36 份种质间分别检测出等位基因171 个和153 个，平均每对引物检测到11.4 个和10.2 个。从检测到的等位基因数目来看，Guan 等[11]开发的SSR 标记的多态性高于前人发表的。

表1 36 份不同种质类型桃品种

表2 2 组SSR 的多态性比较

2.2 核心引物筛选

采用毛细管电泳方法，根据36 份不同种质类型桃品种的15 对SSR 引物扩增结果，从中筛选出扩增带清晰、稳定性强、容易识别的引物。最终从15 对SSR 引物中筛选出可用于桃品种鉴定的核心引物10 对，扩增的条带大小为100～300 bp（表3）。

表3 10 对核心SSR 引物的序列和位置信息

2.3 登记桃品种SSR 指纹图谱构建

《中华人民共和国种子法》规定品种需进行DUS 测试才能登记、审定及保护，因此，需加强对登记品种的指纹图谱构建工作，为桃苗木认证、品种登记和新品种保护提供理论技术支撑。本研究利用上述筛选出的10 对核心引物，对24 份登记品种进行扩增，获得它们的真实扩增片段大小（表4）。对检测的位点逐一进行比较，发现24 份登记品种的SSR 谱带大小均不相同，即10 对SSR 核心引物能够将所有登记品种区分开。

表4 24 份登记品种指纹图谱

2.4 观赏桃SSR 指纹图谱构建

观赏桃以其花型多样、花色丰富、花期长、色泽鲜艳等特点深受人民的喜爱。目前，花卉市场品种混杂，“同物异名”和“同名异物”现象常有发生。本研究基于上述开发的10 对核心SSR 引物对31 份观赏桃种质进行分子鉴定，获得它们的扩增片段大小，对检测的位点逐一进行比对。结果显示SSR标记可将所有供试样本清晰地区分开来。说明本研究所选标记足以区分不同材料，利用SSR 标记进行观赏桃分子鉴定具有较强的可靠性。另外，10 对引物构建的观赏桃DNA 分子身份证具有唯一性，可实现对供试观赏桃品种的精确、快速鉴定（表5）。

表5 构建31 份观赏桃品种（系）的指纹图谱

续表5

2.5 品种纯度鉴定

桃树除了无花粉品种外，有花粉的品种均可以自交结实，但在自交过程中容易受其他品种的花粉污染。

因此，加强对种质纯度的鉴定尤为重要。以40个‘中油蟠13 号’自交系后代为试材，从上述10对核心引物中随机选择5 对进行扩增。从扩增结果看出（表6），‘中油蟠13 号’的1、30 号样本均在SSR152 位点的等位变异相差2 bp，依据农业行业标准《桃品种鉴定SSR 分子标记法》的判定方法，样品间的差异位点数＝1，判定为“近似样品”。而样本20、37 号在SSR184 位点的等位差异位点数均≥2，判定为“不同样品”。说明‘中油蟠13 号’自交系后代纯度为95%。

表6 10 对核心引物对40 个桃自交系后代纯度的鉴定

3 讨论与结论

3.1 引物多态性

扩增结果表明，本研究筛选出的10 对核心引物的多态性比较丰富。陈霁等[12]利用16 对位于李属植物上的SSR 标记在42 份观赏桃种质中平均每对引物扩增出的等位基因数是7.75 个；陈昌文等[6]筛选出16 对SSR 引物在237 份桃种质中平均每对引物对品种扩增的等位基因数是12.7 个，而本研究中平均每对引物扩增的等位基因数是11.4 个。但这并未反映本研究中的引物多态性的高低，只是验证了引物扩增条带数与种质数量、遗传背景等有关。本研究10 对引物的多态性条带比率为98.02%，足见其多态性比较丰富。

3.2 核心引物选择

选择合适的引物组合是构建桃分子身份证的重要前提。引物组合的大小反映出组合中引物自身的多态性，也可以反映组合对种质的区分能力[13]。因此，核心引物的选择至关重要。本研究用于筛选的15 对SSR 引物的多态性高于前人发表的[10]，且该引物均是基于重测序数据获得的，在桃上具有较高的特异性。同时，依据等位基因大小进行核心引物的筛选，既考虑了它们在品种间的多态性又兼顾引物组合的数量，但引物的多态性不等同于引物组合的多态性。通过“最优组合”，本研究获得10对多态性高、重复性好、条带清晰且区分能力最强的最少引物组合的SSR 标记作为核心引物。

3.3 分子身份证的构建

近几年，研究者们分别构建了苹果[14]、梨[15]、葡萄[16]、草莓[17]、西瓜[18]等果树的分子身份证。目前构建分子身份证的编码方法主要有3 类[19]。第1 类是根据标记的有无，将图谱转化为1 和0 组成的字符串，即构成分子身份证，但矩阵文件字段过长不利于数据间的比较；第2 类是将每对引物扩增的条带按从小到大排列，依次赋值，但忽略了品种相应位点的真实带型；第3 类是本研究所采用的，记录每个位点原始带型数据，能够真实地反映品种的指纹信息，且在品种鉴定时往往是进行相似品种个别位点间的比对，解决了上述方法中从分子身份证号码回溯真实扩增带型的难题。

3.4 数据库的可扩充性

目前认为SSR指纹图谱技术是最为成熟的一项技术。然而，果树种质中存在大量的芽变及姊妹系品种，且每年选育的新品种都有近百个[20]，所以必须建立新品种的分子身份证来及时更新数据库。理论上每对引物最多可以有3 种带型（X/X、Y/Y、X/Y），所以利用所选的10 对引物最多可以区分59 049（310）个桃品种，可以满足现在及将来对桃品种鉴定的要求。此外，随着桃品种的不断增多，本研究中利用的10 对核心引物可能不能将有些品种区分开，此时可从187 份引物[11]中继续添加引物使用来进行品种鉴定。