伪狂犬病毒HuB2020株的分离与鉴定

翟 瑶，周丹娜，梁 婉，杨克礼，袁芳艳，郭 锐，李 鹏，田永祥

（1.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉 430064）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒引起的一种急性传染病，主要表现为发热、呼吸道症状和神经症状等［1］。伪狂犬病毒能感染多种家畜及野生动物，而猪是伪狂犬病毒的自然宿主，且其最为易感，发病情况也最为严重［2］。伪狂犬病毒（Pseudo⁃rabies virus，PRV）可以引起种猪繁殖障碍，新生仔猪神经症状及急性死亡、生长猪及育肥猪出现呼吸道症状等［3-5］。其临床症状取决于感染猪的日龄、感染途径、感染毒株的毒力及自身免疫情况等［6］。目前，猪伪狂犬病在全球范围内广泛流行，给世界养猪业造成严重的经济损失。因此，很多国家采取了PRV净化策略，欧洲的多数国家及加拿大、美国和新西兰等已经根除了该病毒［7，8］。随着规模化养殖场的增多，2011年中国PRV出现了许多的变异毒株［9］，导致养殖场即使免疫了Bartha-K61疫苗也无法达到免疫效果。本研究从临床病料中分离纯化出1株猪伪狂犬病毒——HuB2020，并对其毒力、培养特性及遗传变异进行了系列研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 从湖北某猪场采集疑似病料，取组织样品于-20℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒。胰酶、青链霉素双抗和胎牛血清均购自Gibco公司，DMEM培养基购自HyClone公司，DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker以及高保真酶PrimeSTAR购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 细胞及试验动物 所用细胞为猪肾传代细胞（PK15），试验动物为6周龄昆明小鼠。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取及PCR检测 将采集的组织病料加适量PBS溶液，匀浆破碎后反复冻融3次，离心取上清。按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书提取DNA。采用伪狂犬gD基因和gE基因外检引物分别用于检测伪狂犬病疫苗毒和野毒。

1.2.2 病毒的分离 以细胞培养瓶进行传代培养，取出细胞培养瓶，弃培养基，用PBS溶液洗细胞2次，加入2 mL DMEM培养基（不含血清）、加入病毒液于37℃中孵育2 h，补足至DMEM（含2%FBS和1%青链霉素双抗）6 mL，同时设置对照组。待80%左右的细胞出现病变并脱落时收取病毒液，于-80℃反复冻融3次后继续传代。将收取的病毒进行纯化，并使其在PK15细胞稳定传代。

1.2.3gE基因序列遗传进化分析 用Primer Pre⁃mier 5设计gE基因长片段引物，PCR扩增获得gE基因，经过测序获取基因序列。通过软件DNAStar分析该病毒基因序列与NCBI上已公布的PRVgE基因序列（表1）的同源性，利用MEGA-X构建系统进化树，对基因序列遗传进化进行分析。

1.2.4 PRV HuB2020株的病毒滴度测定 从培养箱中取出已铺好的96孔板，将纯化后的病毒液按10倍梯度稀释，取10-1～10-88个稀释梯度接种于96孔板，每个稀释度8孔，每孔接种100μL，并设置阴性对照，对照孔每孔加入100μL DMEM。将96孔板置于37℃恒温培养箱，每天记录观察，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.2.5 PRV HuB2020株在PK15细胞中的一步生长曲线 取细胞培养瓶，弃培养基，用PBS溶液清洗细胞2次，加入1 mL含100 TCID50的病毒液，于37℃CO2培养箱孵育2 h。然后换成2%FBSDMEM培养基，每隔12 h（12、24、36、48、60、72、84、96 h）吸取细胞上清液300μL，并补充同等体积的2%FBSDMEM培养基，测定8个时间节点病毒液的TCID50，并绘制生长曲线。

表1 PRV参考毒株信息

1.2.6 动物实验 6周龄昆明小鼠100只，分为5组，每组20只。分别以103.0、104.0、105.0、106.0TCID50/0.1 mL的滴度分别接种4组小鼠，接种剂量为0.1 mL，接种途径为背部皮下注射，同时以20只小鼠注射同样剂量的DMEM培养液作为阴性对照。接种后观察小鼠临床症状及死亡情况，按照Reed-Muench法分别计算病毒的半数致死量LD50，并以PCR方法检测病毒在各组织的分布情况。每只小鼠分别取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏以及脑组织，破碎后取上清，按照AxyPrep的DNA/RNA提取试剂盒说明书提取组织DNA，以提取的组织DNA为模板进行PCR扩增，结果用GraphPad Prism5进行分析。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

提取组织病料基因组DNA，用伪狂犬外检引物进行检测。对分离出的病毒进行PRVgD基因和gE基因短片段的PCR扩增，结果（图1）表明，扩增出217 bp和368 bp的特异性目的条带，与预期大小相符。

图1 PRV gD/gE基因PCR检测结果

2.2 病毒分离结果

将收集的病毒液在PK15细胞上进行传代培养，细胞在接毒24 h后有明显的细胞病变，细胞变大变圆，呈空泡状（图2）。

图2 HuB2020株感染PK 15的病变观察（100×）

2.3 病毒生长动力学结果

HuB2020株在PK15细胞上的一步生长曲线结果如图3所示。由图3可以看出，HuB2020株在36 h达到最高值106.5TCID50/0.1 mL，即107.5TCID50/mL，然后病毒滴度逐渐降低（图3）。

图3 HuB2020株在PK 15细胞上的一步生长曲线

2.4 gE基因遗传进化分析结果

提取病毒基因组DNA扩增gE基因长片段结果如图4所示。由图4可以看出，成功扩增出2 281 bp的特异性目的条带，并与NCBI上已发表的序列进行遗传进化分析，HuB2020株gE基因核苷酸序列与国外报道的PRV毒株的核苷酸序列同源性为97.6%～99.3%，与国内报道的PRV毒株的核苷酸序列同源性为98.9%～99.9%；HuB2020株gE基因编码的氨基酸序列与国内流行变异株同源性为98.9%～99.9%，与 国 内 经 典 株Ea、Fa、TJ、HeN1等 的 同 源 性 为99.6%～99.8%，与国外经典株Becker、Kaplan株等同源性为97.6%～97.9%。同时，基于gE基因的系统进化树分析发现，PRV-HuB2020株与国内分离株属于相同分支，亲缘关系较近，与国外PRV经典毒株Becker不属于同一进化树分支，亲缘关系较远（图5）。

图4 gE基因长片段扩增

2.5 动物试验结果

结果表明，106.0、105.0TCID50/0.1 mL攻毒组对小鼠的致死率为100%。感染HuB2020株的昆明小鼠半数致死量（LD50）为1×105.7。小鼠存活数量随着稀释度升高而增多（图6）。PCR检测组织嗜性分布结果显示，106.0、105.0TCID50/0.1 mL攻毒组对小鼠的神经嗜性高达100%，且病毒在脑组织和心脏组织中的检出率均显著高于其他组织（图7）。

图5 HuB2020株gE基因核苷酸系统进化树

图6 小鼠攻毒后存活情况

图7 小鼠组织感染情况

3 小结与讨论

伪狂犬病是在世界范围内广泛流行的一种动物传染病，而且动物一旦感染，可终身带毒、难以根除。随着规模化养殖场的增多，即使免疫了传统伪狂犬疫苗也无法提供完全保护，甚至出现了许多的伪狂犬变异毒株。而目前对于该病的防控仍以疫苗免疫预防为主［10］。猪是伪狂犬病毒的主要宿主和惟一自然储存宿主，感染该病毒的猪因日龄不同表现出不同的症状，新生仔猪感染后出现神经症状及急性死亡，死亡率高达100%，生长猪以及育肥猪在感染后出现呼吸道症状等。目前，使用疫苗免疫仍然有流行变异株的出现，使伪狂犬病毒在宿主体内适应后发生基因突变，这些适应性的突变也正是伪狂犬病毒实现跨宿主传播而感染人。有研究报道伪狂犬病毒感染人的病例，但未能分离出病毒，Liu等［11］首次从人脑脊髓液中分离出伪狂犬病毒，该毒株与中国伪狂犬病毒流行变异株有着相似的生物学特性，这也进一步表明伪狂犬病毒的可跨种传播性，使伪狂犬病毒的防控已经不再局限于动物，还有养殖行业的工作人员以及研究人员。目前在中国广泛使用的疫苗有Bartha-K61、HB98、Ea株等，在伪狂犬病的临床上有一定的防治作用，但对阻止病毒变异和传播方面尚未有较好的效果。

本研究以PK15细胞从湖北省某猪场的疑似病料中分离出一株伪狂犬病毒。该病毒在PK15细胞上可以稳定地增殖和传代，并表现出明显的伪狂犬病毒的细胞病变，感染病毒的细胞出现空泡，变大变圆；病毒纯化后测定该病毒最高滴度为107.5TCID50/mL。gE基因长片段的遗传进化分析结果表明，该毒株与2011年以来国内流行变异株同属于一个分支，遗传关系较近。小鼠攻毒试验结果显示，PRV-HuB2020株对小鼠毒力较强，对小鼠的半数致死量LD50为1×105.7，相较于Rui等［12］以SC株传统强毒株的小鼠试验的毒力更强。组织PCR检测组织嗜性分布结果显示，该毒株对小鼠具有极强的神经嗜性，且病毒在心脏组织中的检出率也显著高于其他组织，而这种对于心脏组织的嗜性在PRV的研究中鲜有报道。

该分离株为伪狂犬流行变异株且与国内流行株同源关系较近，在PK15上增殖稳定且对小鼠有高致死率，具有显著的神经嗜性及心脏组织嗜性。目前对于PR的防控主要以免疫疫苗为主，PRV仍在处于不断变异的过程，对于养殖行业来说依旧有着潜在的风险。