外周血单个核细胞EBV-DNA在非霍奇金淋巴瘤预后监测中的临床应用价值*

张扬 戴春阳 华艳 陈少华 陈兆武 李明

非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）是常见的来源于淋巴细胞的血液系统恶性肿瘤，病变主要发生在淋巴结、脾脏、胸腺等淋巴器官，也可以发生在淋巴结外的淋巴组织。NHL在我国发病率超过所有淋巴瘤的80%，发病率和死亡率呈逐年上升趋势。NHL患者常有无痛性进行性淋巴结肿大的共同临床特点，但在不同的病理类型、受侵犯的部位和侵袭程度等方面又有很大差异[1]。目前导致NHL发病率增高的原因尚不清楚，通常认为是免疫功能、病毒感染、细菌感染、遗传因素、化学物质等多种因素共同作用的结果。

近年来一些研究发现，NHL的发生与EB病毒（Epstein-Barr virs，EBV）的感染有着密切的关系[2]，为了进一步探讨EBV在NHL患者中的临床意义，本研究采用荧光定量聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测421例NHL患者外周血单个核细胞中EBV-DNA载量，分析在不同性别、年龄、病理类型、临床分期、淋巴瘤B症状和不同预后等因素中的EBV感染差异，比较EBV感染者和EBV未感染者各项临床指标的差异，并随访97例接受治疗的NHL患者，以期探讨EBV-DNA在NHL患者预后监测中的临床应用价值。

材料与方法

1 一般资料 选择2017年4月～2020年9月期间，在中国科技大学附属第一医院西区（安徽省肿瘤医院）住院治疗的非霍奇金淋巴瘤患者421例，其中男性247例，女性174例，年龄13～89岁，平均年龄55.6（47.5，67.0）岁。本研究已通过伦理审查（伦理备案号：2021-JYK-01）。所有患者均经组织活检病理学确诊，组织病理分型参照2016年WHO制定的淋巴组织肿瘤分型标准[3]，成熟B细胞来源淋巴瘤303例，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）199例，套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）30例，慢性淋巴细胞白血病（Chronic lymphocytic leukemia，CLL）24例，滤泡性淋巴瘤（Follicular lymphoma，FL）20例，高级别B细胞淋巴瘤（High grade B-cell lymphoma，HGBL）14例，边缘区淋巴瘤（Marginal zone lymphoma，MZL）10例，Burkitt淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）6例。成熟T和NK细胞来源淋巴瘤118例，包括结外NK/T细胞淋巴瘤（Extranodal NK/T-cell lymphoma，ENKTL）50例，T细胞淋巴瘤（T-cell lymphoma，TCL）21例，外周T细胞淋巴瘤（Peripheral T-cell lymphoma，PTCL）20例，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（Angioimmunoblastic T-cell lymphoma，AICL）17例，间变性大细胞淋巴瘤（Anaplastic large cell lymphoma，ALCL）10例。临床分期按照Ann Arbor改良分期法进行分类[4]，临床分期明确患者共330例，包括Ⅰ+Ⅱ期84例，Ⅲ期99例，Ⅳ期147例。根据患者是否有全身症状（B症状）分为A组和B组，患者有以下临床表现之一时即有淋巴瘤B症状：①无感染原因的发热（体温＞38℃）＞3天；②盗汗；③6个月内体重下降＞10%。

NHL的国际预后指数（international prognostic index，IPI）是将年龄大于60岁、分期为Ⅲ期或Ⅳ期、结外病变1处以上、需要卧床或生活需要别人照顾、血清乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）升高5个预后不良因素综合后对患者进行预后分级，分为低危（0～1分）、低中危（2分）、高中危（3分）、高危（4～5分）4类。对于年龄＜60岁的患者，使用年龄调整的IPI（age adjusted international prognostic index，aa-IPI）进行预后分组，而近年多项研究表明美国国家综合癌症网络IPI（National comprehensive cancer network，NCCN-IPI）评分系统能更有效的判断预后[5]。因此综合3种预后分层模型，对97例初诊NHL患者进行预后分级，包括低危17例，低中危19例，高中危33例，高危28例，统计其初诊未治疗前和最近一次治疗后EBV-DNA阳性率及载量差异。

将421例NHL患者按照EBV阴阳性分组，EBV阴性组245例，阳性组176例，比较两组患者共计15项临床指标差异，包括红细胞总数（RBC）、血红蛋白（Hgb）、白细胞总数（WBC）、血小板（PLT）、前白蛋白（PA）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、线粒体型天门冬氨酸氨基转移酶同工酶（mAST）、碱性磷酸酶（ALP）、α-L-岩藻糖苷酶（AFU）、乳酸脱氢酶（LDH）、胱抑素蛋白酶抑制剂C（CysC）、视黄醇结合蛋白（RBP）、β2-微球蛋白（β2-MG）。

随访包括门诊复查、电话随访以及再次入院治疗等形式，治疗结束后第一年每3个月复查一次，第二年每6个月复查一次，三年后每年复查一次，复查内容包括血常规、肝肾功能、LDH、β2微球蛋白以及其他辅助检查，随访截止时间2020年9月30日，记录患者疾病发展或者复发的日期，无进展生存期（Progression-Free-Survival，PFS）选择疾病获得完全缓解至疾病复发、进展或末次随访时间进行统计。对共计30项影响因素和临床指标进行单因素及多因素预后分析，包括年龄、性别、病理类型、EBV阳性率、淋巴瘤B症状、RBC、Hgb、WBC、PLT、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、NLR、PLR、LMR、红细胞体积分布宽度变异系数（Coefficient of variation in the width of erythrocyte volume distribution，RDW-CV）、红细胞体积分布宽度标准差（Standard deviation of RBC volume distribution width，RDW-SD）、PA、ALB、ALT、AST、mAST、ALP、AFU、LDH、CysC、RBP、β2-微球蛋白、PNI和SII。其中LMR指的是外周血淋巴细胞绝对值计数（Absolute lymphocyte count，ALC）和单核细胞绝对值计数（Absolute monocyte count，AMC）的比值，NLR指的是外周血中性粒细胞绝对值计数和淋巴细胞绝对值计数的比值，PLR指的是血小板计数和淋巴细胞绝对值计数的比值。预后营养指数（PNI）=白蛋白+5×外周血淋巴细胞计数，系统性免疫炎症指数（SII）=中性粒细胞计数×血小板计数/淋巴细胞计数。

2 方法

2.1 试剂与仪器：外周血单个核细胞EB-DNA载量PCR试剂盒（艾康生物技术有限公司，杭州），荧光定量PCR扩增仪为Roche Light Cycler 480（Roche公司，德国）。

2.2 标本采集：用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝管采集患者外周静脉血2 mL，采集后立即上下颠倒混匀5～8次后送检。

2.3 EB-DNA检测和阳性判断标准：取混匀后抗凝外周静脉血500 μL置于1.5 mL去酶离心管中，加入稀释后的1 mL红细胞裂解液（50倍稀释），充分颠倒混匀后，室温静置5 min，随后5 000 r/min离心5 min，小心弃去上清液；再加入500 μL稀释后红细胞裂解液，充分颠倒混匀，室温静置5 min后，5 000 r/min离心5 min，弃去上清液，小心留取管底沉淀。在沉淀中加入50 μL核酸提取液，混匀后涡旋振荡，100℃干浴10 min，随后12 000 r/min离心10 min，上清液即为DNA模板，可随即进行PCR扩增。EB-DNA PCR反应体系共40 μL：35.6 μL mix反应混合液+0.4 μL Taq酶+4 μL DNA模板。扩增条件：95℃ 5 min →[94℃ 15 s → 60℃ 30 s]（共40个循环），严格按照试剂和仪器说明书操作，以试剂说明书中循环次数Ct（threshold cycle value，Ct）≤38且增长曲线呈S型为阳性判断标准。

3 统计学处理 使用SPSS 25.0软件进行数据统计及分析，分类变量用频数、百分率进行描述。经K-S检验后，正态分布资料用表示，非正态分布资料用中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，EBV阳性率比较使用卡方检验（Chi-square test，χ2），任一变量＜5时使用Fisher精确检验，多组间卡方检验使用Bonferroni法调整α水平，两两比较差异。EBDNA载量两组间比较用非参数Mann-Whitney U检验，多组间数据分析比较用非参数Kruskal-Wallis H秩和检验，多组间有差异时进一步采用Dunn法进行多重比较。治疗前后NHL患者EBV阳性率用非参数配对McNemar检验，EBV-DNA载量用非参数配对Wilcoxon秩和检验。EBV阴性组和EBV阳性组之间不同临床指标的差异采用t检验。生存分析采用Kaplan-Meier法计算，用Log-Rank进行预后单因素分析，用Cox比例风险模型进行预后多因素分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。表格中★表示P值＜0.05，差异有统计学意义。

结 果

1 患者外周血单个核细胞EBV-DNA阳性率和载量421例NHL患者外周血单个核细胞EBV-DNA阳性率为41.8%（176/421例），EBV-DNA载量中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]为0.0 （0.0，1550.0）copies/mL。

2 不同临床特征的NHL患者外周血单个核细胞EBVDNA阳性率和载量比较 不同年龄组NHL患者的EBVDNA阳性率随着年龄增长不断增高（χ2=8.179，P=0.042），两两比较后，发现31～50岁组分别和51～70岁组（χ2=5.144，P=0.023）及＞70岁组差异有统计学意义（χ2=6.893，P=0.009）。T和NK细胞来源的NHL患者EBV-DNA阳性率（χ2=88.122，P＜0.001）和载量（Z=-9.949，P＜0.001）明显高于B细胞来源的NHL患者。有淋巴瘤B症状的NHL患者EBV-DNA阳性率（χ2=15.010，P＜0.001）和载量（Z=-4.099，P＜0.001）明显高于没有B症状的NHL患者。而不同性别、临床分期的患者EBV-DNA阳性率和载量均无统计学意义（见表1）。

表1 不同临床特征的NHL患者EBV-DNA阳性率和载量比较

3 不同组织病理分型的NHL患者外周血单个核细胞EBV-DNA阳性率和载量比较 成熟B细胞来源的NHL患者EBV-DNA阳性率（χ2=12.885，P=0.036）和载量（H=15.393，P=0.017）差异均有统计学意义（见表2），其中CLL最高。阳性率两两比较后，发现FL分别和CLL（χ2=8.046，P=0.008）及MCL（χ2=5.357，P=0.026）差异有统计学意义，CLL和DLBCL（χ2=6.602，P=0.010）差异有统计学意义。载量两两比较后，发现HGBL和CLL（Z=-2.309，P=0.047）差异有统计学意义， FL分别和CLL（Z=-3.023，P=0.003）及MCL（Z=-2.501，P=0.012）差异有统计学意义，DLBCL和MCL（Z=-2.263，P=0.024）差异有统计学意义。

表2 不同组织病理分型NHL患者EBV-DNA阳性率和载量比较

成熟T和NK细胞来源的NHL患者EBV-DNA阳性率（χ2=12.459，P=0.010）和载量（H=12.134，P=0.016）差异均有统计学意义（见表2），其中ENKTL最高。阳性率两两比较后，发现ENKTL和其他三种类型相比差异均有统计学意义[TCL（χ2=9.537，P=0.004）， ALCL（χ2=7.385，P=0.007）， PTCL（χ2=5.647，P=0.027）]，其余组两两比较均无差异。载量两两比较后，发现ENKTL分别和ALCL（Z=-2.641，P=0.008）及PTCL（Z=-2.708，P=0.007）差异有统计学意义。

4 不同IPI评分预后的NHL患者外周血单个核细胞EBV-DNA阳性率及载量比较 低危、低中危、高中危、高危4组之间在治疗前及治疗后阳性率均无显著差异，低危组（Z=52.688，P＜0.001）和高中危组（Z=26.521，P＜0.001）治疗后阳性率显著下降（见表3）。低危、低中危、高中危、高危4组之间在治疗前载量无显著差异，治疗后各组之间载量（H=7.889，P=0.048）的差异有统计学意义，低危组（Z=-2.911，P=0.004）、低中危组（Z=-2.193，P=0.028）和高中危组（Z=-1.974，P=0.048）治疗后EBV-DNA载量明显下降（见表4）。

表3 不同IPI评分预后的NHL患者EBV-DNA阳性率比较

表4 不同IPI评分预后的NHL患者EBV-DNA载量比较

5 EBV阴性组与EBV阳性组NHL患者临床指标比较 15项临床指标中EBV阳性组前白蛋白（PA）（t=3.750，P＜0.001）、白蛋白（ALB）（t=4.707，P＜0.001）、视黄醇结合蛋白（RBP）（t=2.684，P=0.008）明显低于EBV阴性组。EBV阳性组β2-微球蛋白（β2-MG）（t=-2.120，P=0.035）明显高于EBV阴性组，其他指标无明显差异（见表5）。

表5 EBV阴性组与阳性组NHL患者临床指标比较

6 EBV阴性组与EBV阳性组NHL患者生存函数和风险函数比较 随访时间波动于2～168个月，中位随访时间22.0个月，随访结束时共有38例患者死亡。将421例NHL患者按照EBV-DNA结果分为EBV阴性组和EBV阳性组，通过生存分析函数和风险函数分析，可见EBV阳性组较阴性组风险高，且生存时间短（见图1，图2）。

图1 EBV阴性组与EBV阳性组NHL患者生存函数比较

图2 EBV阴性组与EBV阳性组NHL患者风险函数比较

7 NHL患者预后因素分析 33个不同临床指标单因素分析结果显示，病理类型（P＜0.001）、EBV（P＜0.001）、B症状（P=0.007）、有无骨髓浸润（P＜0.001）、PA（P=0.048）和CysC（P=0.021）6个指标与患者的预后显著相关（见表6）。对此6个指标进行多因素分析后，发现病理类型（P=0.013）、EBV（P=0.015）、有无骨髓浸润（P＜0.001）和CysC（P=0.027）4个指标是NHL患者的独立预后因素（见表6）。

表6 影响患者生存预后的单因素和多因素分析

8 成熟B细胞来源与成熟T和NK细胞来源的NHL患者生存函数和风险函数比较 将421例NHL患者按照不同病理类型分为成熟B细胞来源组与成熟T和NK细胞来源组，通过生存分析函数和风险函数分析，可见成熟T和NK细胞来源组较成熟B细胞来源组风险高，且生存时间短（见图3，图4）。

图3 成熟B细胞来源组与成熟T和NK细胞来源组NHL患者生存函数比较

图4 成熟B细胞来源组与成熟T和NK细胞来源组NHL患者生存函数比较

讨 论

EBV于1964年首次在非洲儿童Burkitt淋巴瘤标本的组织培养中发现，是一种嗜人淋巴细胞的双链线性DNA病毒，具有嗜淋巴细胞和上皮细胞的特性。EBV在人群中普遍易感，约90%～95%的人存在EBV感染，以潜伏感染最为常见。在少数人群中与肿瘤的发展相关，多项研究已证实EBV感染与鼻咽癌等疾病密切相关[6]，每年约有14万人死于EBV相关的肿瘤[7]。目前临床上检测EBV的方法主要有原位杂交检测EBV编码小RNA（EBV-encoded small RNA，EBER）、外周血检测EBV-DNA和血清检测EBV抗体[8]。原位杂交技术检测EBER虽然灵敏度高，但为有创操作，在临床上进行动态监测时具有一定局限性。EBV抗体是抗EBV衣壳抗原（Epstein-Barr virus viral capsid antigen，EBV-VCA）的IgM/ IgG/ IgA抗体，但IgM抗体在一些急性感染的儿童和成人不会产生，且容易与其他病毒发生交叉反应，造成不典型患者的漏诊。外周血EBV-DNA检测的样本类型主要为血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），检测的是溶解的线性或游离的环形DNA，可以反映患者病情的波动和病毒复制情况。PBMC中EBV-DNA拷贝数一般远高于血浆[9]，因此对于EBV感染者，检测PBMC EBV-DNA更为灵敏，便于进行临床治疗后的动态监测。

不同NHL患者在临床特征、细胞来源、分子特征等方面都具有异质性，在疗效和预后方面也有显著差异，而研究也证实外周血单个核细胞中EBV-DNA在不同NHL患者以及不同临床表征中有差异性表达[10]。本研究中EBV-DNA随着患者年龄增加不断增高，可能是因为机体免疫系统的退化导致了机体对EBV的免疫清除功能减弱。而T和NK细胞来源NHL患者的EBV-DNA阳性率和载量都明显高于B细胞来源的NHL患者，其中结外NK/T细胞淋巴瘤约占11.9%，但EBV感染率高达92%，说明EBV可能对某一免疫表型的淋巴瘤具有特殊亲和力。朱悦红等[11]研究发现淋巴瘤B症状是NHL患者的独立预后因素，这与我们的研究结果一致，有淋巴瘤B症状的NHL患者EB-DNA阳性率和载量明显高于没有B症状的患者，说明感染了EBV的NHL患者更容易出现发烧、盗汗、体重明显下降等全身症状，可能是病毒感染机体后产生的应激反应。

NHL预后与疾病的类型、侵袭程度、临床分期、分子遗传学、免疫学等多种因素相关。有研究针对不同亚型淋巴瘤进行了全外显子测序，发现一些表达异常的基因和蛋白，可能是潜在的治疗靶点[12]，但高昂的费用和测序结果的判读难度限制了其在临床的应用，因此更需要简便可靠的指标来辅助判断NHL患者的预后。目前临床普遍使用的IPI预后评分系统包含5个预后因素：年龄、分期、体能状态（performance status，PS）、结外病灶个数和血清LDH水平，但缺乏反映肿瘤分子生物学特性和机体免疫状态的指标，尤其对分辨高危患者具有明显的局限性[13]。本研究将97例治疗前后随访的NHL患者按照IPI分为低危、低中危、高中危、高危4组，4组患者在治疗前的EBV-DNA载量没有差异，但是治疗后各组之间载量产生明显差异，低危组、低中危组和高中危组治疗后EBV-DNA载量明显下降，但高危组治疗后载量没有下降，说明高危组预后不良。外周血EBV-DNA载量可以反映EBV感染相关的NHL患者体内的淋巴瘤负荷大小，血浆EBV-DNA载量监测不但能够反映患者体内肿瘤状况，对治疗效果进行观察评估，还有助于在较早阶段识别高危患者，便于早期选择个体化治疗方案，提高疗效，改善预后。

越来越多文献证明肿瘤相关炎症反应参与肿瘤的进展[14]，机制可能是肿瘤相关炎症细胞释放一系列的炎性介质、细胞因子、酶类物质，造成血管通透性改变，过量释放的炎性介质导致氧化损伤，改变了肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），从而更有利于肿瘤细胞的生存和繁殖。TME是由肿瘤组织内各种免疫细胞、成纤维细胞和细胞因子等组成的一个动态网络系统，与肿瘤细胞的增殖、血管形成、侵袭和转移有密切关系。浸润的免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞等是机体免疫系统的重要组成部分，TME和机体免疫状态对预后都有一定影响[15]，因此临床上一些反映炎症状态和免疫状态的常规血液学指标对于患者而言也可能具有一定的预后价值。本研究比较了EBV阳性患者和EBV阴性患者15项常规血液学指标的差异，EBV阳性患者β2-微球蛋白明显高于未感染者，EBV感染的NHL患者前白蛋白（PA）、白蛋白（ALB）和视黄醇结合蛋白（RBP）都明显低于未感染者，且风险较高，生存时间较短，这都说明了EBV感染确实会影响NHL患者的炎症状态和免疫状态。

目前临床上常见的炎症和免疫相关血液学指标中，中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞水平都可以反映机体的免疫状态。红细胞分布宽度（red cell volume distribution width，RDW）提示了外周血红细胞体积的异质性，炎症反应可以导致红细胞成熟障碍使得RDW升高，与炎症指标CRP、ESR水平有一定相关性，也能反映机体的炎症状态[16]。近年来通过对这些常见指标进行计算所得的新指标与NHL患者预后的研究也得到越来越多的关注，如ALC/AMC（LMR）体现了免疫系统抗肿瘤与肿瘤所致免疫抑制状态间的相对强弱，动态观察LMR有利于识别部分预后不良的患者[17]。高中性粒细胞/淋巴细胞比率（NLR）可作为NKTL的独立预后指标，用于患者的风险分层。NLR、血小板和淋巴细胞比率（PLR）与多种炎症性疾病的发病过程相关，可作为DLBCL的临床预后指标[18]。本研究对这些炎症和免疫相关血液学临床指标进行单因素和多因素分析后发现：组织病理类型、EBV感染、有无骨髓浸润和CysC水平4个指标是NHL患者的独立预后因素。本研究中T和NK细胞来源的NHL患者EBV感染率明显增高，且生存期短预后差。EBV-DNA代表了肿瘤负荷的大小，载量的变化可以用来对患者进行预后分层，是评估患者预后的独立因素，但CysC目前在NHL患者中的作用少有报道。CysC主要通过半胱氨酸激酶途径调节炎症反应、吞噬活性以及细胞外基质产生和降解的平衡，目前在临床上可用于慢性肾脏疾病和静脉血栓栓塞等疾病的预后评价[19，20]，但尚未应用于NHL患者的预后监测中。本研究的发现有助于联合使用多项临床指标构建NHL预后模型，为改善患者预后提供可能。

EBV在NHL中影响肿瘤发生发展的作用机制目前尚不清楚，有研究认为是由于UHRF1、DNMT1和DNMT3B在Burkitt淋巴瘤起源的生发中心B细胞中上调，提供了B细胞和EBV潜伏感染之间的分子链接[21]。也有研究通过广泛的生物信息学分析和实验模型发现EBV阳性淋巴瘤存在显著的EBV编码的miRNA过表达，可能通过不同的转录调控机制发挥功能，而EBV与宿主的相互作用最终决定了EBV的潜伏感染模式[22]。还有研究认为螺内酯对EBV的抗病毒活性是通过降解XPB蛋白介导的，因此XPB可能成为控制EBV感染的有效治疗靶点[23]。这些研究结果都提示，合理的治疗靶点可以有效调控EBV癌蛋白的表达，如miRNAs主要与体内肿瘤细胞的免疫逃逸相关，靶向EBV miRNAs可以促进免疫反应并限制EBV相关的病理改变[24]。Pembrolizumab作为程序化细胞死亡蛋白1（PD-1）抑制剂，抑制T细胞PD-1与肿瘤细胞上程序化细胞死亡配体1 （PD-L1）的相互作用，可能是复发或难治性NHL的一种潜在治疗选择，但其对EBV阴性、PD-L1低表达或缺失的NHL患者的疗效尚不清楚[25]。随着近年来研究的逐渐深入，研究者认为预防性的使用EBV疫苗可以减少由EBV引起的许多疾病，有可能降低这些疾病的发病率和严重度[26]。

通过本次系统性回顾性研究发现，EBV在NHL发生、发展、转归的整个过程中都发挥着重要作用，外周血单个核细胞中EBV-DNA与其他指标联合使用，配合IPI评分，可能成为更有效的预后评分系统，能更好地进行风险分层、评估预后、监测复发。因此临床实践中加强监测EBV相关恶性肿瘤患者外周血单个核细胞中EBV-DNA载量的变化，对有效判断患者疾病状态和监测预后均有指导意义。而对于EBV的具体致病机制，后续我们将开展更进一步的前瞻性研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突