健脾益气摄血方调控原发免疫性血小板减少症肠道免疫机制研究

黄子明 侯丽 李蕊白 王冲 何昊 杨盼 张雅月

摘要 原发免疫性血小板减少症（ITP）是一种以血小板减少为特征的自身免疫性疾病，其发病机制、发病原因目前尚未完全明确。ITP的中医病名为“紫癜病”。陈信义教授团队认为ITP的病机为“脾气亏虚、脾不统血”，拟定健脾益气摄血方，临床上取得良好疗效。并为此开展一系列临床和基础研究证实其免疫调控效果，以期阐明其具体起效机制。文章就陈信义教授在开展国家重点基础研究发展计划（“973”计划）项目临床试验过程中对健脾益气摄血方治疗ITP研究所采用的免疫指标进行概括和讨论。

关键词 健脾益气摄血方;原发免疫性血小板减少症;免疫

Study on the Intestinal Immune Mechanism of Jianpi Yiqi Shexue Formula in Regulating Primary Immune Thrombocytopenia

HUANG Ziming1，HOU Li1，LI Ruibai1，WANG Chong1，HE Hao2，YANG Pan1，ZHANG Yayue1

（1 Hospital Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Xi′an Medical University，Xi′an 740000，China）

Abstract Immune thrombocytopenia （ITP） is an autoimmune disease characterized by thrombocytopenia，and its pathogenesis and causes have not been completely clarified.ITP′s TCM disease is called “purpura”.Professor CHEN Xinyi′s team thinks that the pathogenesis of ITP is “spleen deficiency and spleen not controlling blood”，so Jianpi Yiqi Shexue Formula has achieved good clinical effect.For this reason，a series of clinical and basic studies have been carried out to confirm its immunomodulatory effect，so as to clarify its specific mechanism.In this paper，Professor CHEN Xinyi summarized and discussed the immune indexes adopted by Jianpi Yiqi Shexue Formula in treating ITP research during the clinical trial of the National Key Basic Research Development Program （“973” Program）.

Keywords Jianpi Yiqi Shexue Formula; Primary immune thrombocytopenia; Immunity

中圖分类号：R242文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.005

原发免疫性血小板减少症（Immune Thrombocytopenia，ITP），原称特发性血小板减少性紫癜，是一种以血小板减少为特征的自身免疫性疾病。多认为由于人体内细胞和体液免疫的异常，产生抗血小板自身抗体导致单核巨噬细胞系统破坏血小板增多。ITP是临床上最常见的出血性疾病，其发病原因目前尚不明确。

1 健脾益气摄血方的方解及疗效

在ITP临床研究和实践过程中，中医药的辅助治疗或支撑治疗显示出独特优势。基于ITP在慢性发病过程证以出血、疲乏等为主要特征，将其归属于中医学的“血证”“发斑”“紫斑”“葡萄疫”“肌衄”“虚劳”等病证范畴。2009年国家中医药管理局组织血液病专家达成共识，将ITP的中医病名统一命名为“紫癜病”[1]。在中医辨证施治原则指导下，陈信义教授科研团队认为ITP病机与脾气亏虚、脾不统血关系密切，当以“健脾益气摄血”为治疗原则，由此拟定出健脾益气摄血方。该处方由生黄芪、党参、茯苓、白术、阿胶、茜草、炙甘草组成。其中黄芪甘温，归脾、肺经，有补中益气，升阳固表之效，善治诸气虚，在方中为君药。配伍党参、茯苓、白术补气健脾为臣，取四君子汤之意，与黄芪合用，以增强其健脾益气之效。阿胶补血止血，滋阴润燥;茜草苦寒，可祛瘀通经，凉血止血，二者配伍止血功效更强，亦能防止君臣药物补益太过，使摄血不留瘀，补血不动血，共为佐药。炙甘草益气和中，调和诸药，为使药。纵观全方，诸药合用共奏健脾益气摄血之功。临床研究表明，健脾益气摄血方的止血疗效要早于糖皮质激素，健脾益气摄血方与激素联合使用的疗效要优于单独使用激素，证实健脾益气摄血方在治疗有效率、缓解西药不良反应方面具有治疗优势，可以快速止血、提升血小板，改善临床症状，且无明显不良反应，治疗效果确切[2-4]。

2 健脾益气摄血方的疗效机制研究

在ITP发病过程中，免疫机制紊乱已被认为是其重要发病机制。陈信义教授在开展国家重点基础研究发展计划（“973”计划）项目临床试验过程中，对健脾益气摄血方开展一系列基础和临床研究，证实健脾益气摄血方具有免疫调控效果。这些研究主要集中在检测淋巴细胞功能指标，如淋巴细胞及其相关亚群（CD3+CD4+细胞、CD3+CD8+、CD19+细胞、CD4+CD25+、CD4+CD25+FoxP3+、CD4+/CD8+）及其分泌的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β1等），免疫球蛋白A（IgA）与血小板相关抗体（PAIgA、PAIgG、PAIgM），以及脑肠轴的血液神经递质上，包括5-羟色胺（5-HT）、β-内啡肽（β-EP）、血管活性肠肽（VIP）、去甲肾上腺素（NE）、缩胆囊素（CCK）等。

ITP的具体发病机制目前尚未完全明确，近几年关于其机制的研究已经拓展到众多领域，其中细胞免疫和体液免疫异常仍是最经典的致病机制。体液免疫紊乱导致ITP发病这一结论源于多数ITP患者血小板表面可以检测到血小板自身反应性抗体的现象，包括血小板相关抗体（PAIg）和血小板特异性抗体（PSIg），这些抗体主要是IgG型，部分是IgM型和IgA型，这些抗体与血小板膜抗原（如GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅠa/Ⅱa、GPⅥ等）结合后形成抗原抗体复合物。血小板表面的自身抗体由B淋巴细胞分化的浆细胞产生，直接通过脾脏巨噬细胞和树突状细胞（DC）清除和破坏血小板，或作用于巨核细胞使血小板的生成减少，从而参与ITP的形成[5]。另一方面，B淋巴细胞也可以通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子调节T细胞的分化和维持，降低NK细胞杀伤功能以及抑制Th1、Th2、Th17细胞的作用，因此其功能受损与多种自身免疫性疾病的发生密切相关[6]。

越来越多的研究表明，细胞免疫机制异常也是ITP发生发展的重要使动因素之一[7]。多种T细胞参与了ITP的发病，主要包括辅助性T细胞（Th1、Th2、Th17）、调节性T细胞（Regulatory T Cell）等。CD4+T细胞是T辅助/诱导细胞（Th/Ti）的表面标志，具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能，起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。CD8+T细胞是T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc）的表面标志，CD8+T细胞具有细胞毒效应，它能抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。CD4+CD25+T细胞是近几年发现的一种特殊的专职免疫调节细胞，可通过抑制T细胞的活化和增殖來维持自身免疫平衡的作用，还能抑制B细胞活化和抗体生成，从而减少抗体介导的自身免疫性疾病的发生[8-9]。

分泌型免疫球蛋白A（SIgA）首先发现于20世纪60年代，是一种主要存在于乳汁、胃肠液、呼吸道分泌液等外分泌液中的IgA抗体[10]。有研究表明，黏膜系统是免疫防御的第一道防线，而SIgA在黏膜免疫应答过程中发挥核心作用，对维持机体免疫稳定具有重要调节效能[11]。NK细胞是与T、B淋巴细胞并列的第3类淋巴细胞，是参与非特异性免疫的重要效应细胞，临床上常用CD16+CD56+作为NK细胞的表面标志物。研究表明，NK细胞可以抑制B细胞的增殖分化，NK细胞表达下降或功能异常可造成免疫功能失调，增加血小板破坏而介导ITP的发生[12]。

20世纪90年代初，随着神经胃肠病学的建立，脑肠轴、脑肠互动的概念也相继被提出。脑肠轴是一个双向调节轴，由脑、肠及肠道微生物所构成，通过神经-内分泌网络有机的将胃肠神经内分泌与中枢神经系统连接起来，涉及神经、内分泌、免疫等多种调节机制。其中发挥重要作用的物质基础为多种脑肠肽，包括5-羟色胺（5-HT）、β-内啡肽（β-EP）、血管活性肠肽（VIP）、去甲肾上腺素（NE）、缩胆囊素（CCK）等神经肽类激素。现代研究发现，脑肠互动与脑肠肽在维持脾脏生理功能正常运转中发挥重要作用[13-14]。在ITP模型复制建立过程中，β-EP、VIP、5-HT、NE等神经递质或血管活性物质也参与了ITP小鼠模型的病理过程。因此，研究给予健脾益气摄血方治疗前后ITP小鼠及ITP患者血清中脑肠肽的变化情况，对于探讨健脾益气摄血方的治疗机制有积极作用。

2.1 临床研究

课题组开展一项中央随机对照、多中心临床试验，观察健脾益气射血颗粒对ITP患者免疫功能的影响，共纳入272例ITP患者，其中观察组（健脾益气摄血组）104例，联合组（健脾益气摄血联合泼尼松组）103例，西药组（泼尼松组）65例;21 d为1个疗程;结果提示，观察组CD4+CD25+细胞治疗后测定值与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.05），其余各组比较差异无统计学意义（P>0.05）;第4次访视点联合组检测的CD3+CD4+细胞、CD19+细胞正常和异常例数，与观察组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;各组治疗前后血小板抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM测定值组内或组间比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明健脾益气摄血颗粒可能通过调节T细胞免疫发挥治疗ITP的作用[2]。另外，研究结果也显示，ITP患者与正常人比较5-HT、VIP、β-EP检测值均下调[15];经健脾益气摄血方治疗后，健脾益气摄血方组、健脾益气摄血方联合强的松观察组β-EP较入组时均升高（P<0.05），VIP均降低（P<0.05），5-HT测定值与治疗前比较差异无统计学意义，说明健脾益气摄血方对脑肠轴功能具有一定的调节效应，也参与免疫性血小板减少症的免疫学发病与临床止血过程[16]。课题组研究研究结果显示，经健脾益气摄血方治疗前后患者血小板活化功能与NK细胞分子标志物表达的差异均无统计学意义，尚不能证实其起效机制与NK细胞相关[16]。

2.2 实验研究

课题组使用注射APS的免疫造膜法成功建立ITP小鼠模型，发现与空白组比较，模型组小鼠血清SIgA含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）;β-EP水平显著升高，5-HT、VIP、NE含量则明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05），CCK水平则差异无统计学意义[17-19]。经健脾益气摄血方干预后，SIgA含量有下调趋势，但与治疗前比较差异无统计学意义（P>0.05）[17];β-EP、5-HT、VIP、NE水平均向正常值恢复，差异均有统计学意义（P<0.05）[19]，进一步证实了健脾益气摄血方对脑肠肽的调控作用。

课题组还观察健脾益气摄血方的疗效与相关细胞因子的关系，研究结果提示，ITP模型小鼠血清和脾脏中的IFN-γ、IL-17A均高于正常组，TGF-β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-27均低于正常组;经过健脾益气摄血方干预后，血清中IFN-γ、TGF-β、IL-2、IL-4均向正常值恢复，脾脏中的TGF-β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A值均向正常值恢复，提示健脾益气摄血方对可能通过调控细胞因子发挥治疗作用。

3 总结与讨论

陈信义教授将ITP的病机概括为“脾气亏虚、脾不统血”，在承担国家重点基础研究发展计划（“973”计划）课题过程中，选择“脾不统血证”患者或建立脾虚证ITP模型小鼠作为研究对象，以健脾益气摄血为治疗原则，运用健脾益气摄血方为治疗药物。临床研究也表明，健脾益气摄血方在治疗ITP上效果显著。

在研究健脾益气摄血方效应机制时，除了观察外周血小板计数、凝血因子等经典指标外，血小板自身反应性抗体、淋巴细胞及其亚群、血液神经递质也可作为药物干预机制研究的疗效指标。综合“973”计划所展开的一系列研究发现，健脾益气摄血方对血小板相关抗体无明显改善效果，淋巴细胞及其相关亚群中也仅对CD4+CD25+细胞数量有提升作用，因此这二者的观测结果尚不能提供健脾益气摄血方具有明确调节免疫功能相关证据。血液神经递质不仅能调节人体免疫，还可参与出血和止血机制。多种神经递质中，β-EP、VIP、5-HT、NE可能作为重要的物质基础在健脾益气摄血方效应机制中发挥作用。但由于临床用药时间设计仅为21 d，尚不能按照ITP疗效评定标准判定疗效。因此，需要更进一步的研究去加强这一结论的科学性和说服力。

另外，脑肠轴学说研究发现，调节肠道功能有可能在防治多个系统疾病中发挥作用。其中肠道功能与人体免疫功能关系密切。VIP在ITP发病中发挥重要作用，而肠道免疫系统中的T淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等都可分泌VIP。课题组在前期研究基础上，提出健脾益气摄血方治疗ITP的效应机制可能与VIP介导的肠道免疫功能失调相关，目前课题组正开展相关基础实验验证此假说，相信在不久的将来就会得出结论。

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（2021-01-05收稿 责任编辑：徐颖）