磁性氧化石墨烯基17β-雌二醇分子印迹复合膜的制备与性能

李 颖,雷 蕊,徐文凯,朱小雪,黄艳凤

(1 天津工业大学 环境科学与工程学院，天津 300387；2 天津工业大学 分离膜与膜过程国家重点实验室，天津 300387)

内分泌干扰素17β-雌二醇(E2)及其主要代谢物雌三醇(E3)和雌酮(E1)主要通过尿液从人体中以硫酸盐和葡糖苷酸缀合物排泄出。事实上，一些游离母体化合物经常被发现在污水中或环境水体中，这一问题引起了人们对水生生物和公共健康的关注。这些化合物一旦进入人体，会造成人体生殖功能的发展变化和影响乳腺肿瘤及其他内分泌紊乱等疾病[1-3]。因此，寻找一种快速高效的方法来吸附去除E2具有重要的意义。

分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)是一种新型的多功能识别材料制备技术，其核心是制备分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer，MIP)。它们不仅具有与抗体相当的特异性识别能力[4]，而且具有成本低，制备容易，机械/化学稳定性好，可重复使用性好等优点[5-9]，已经广泛应用于纯化和分离，化学、生物传感器，药物输送等领域[10-15]。然而，分子印迹仍面临一定的挑战，基于广泛的粒度分布和大面积较深的结合位点，导致特异性结合位点较少和阻碍了模板的重新绑定。为了解决这个问题，引入可逆加成-断裂链转移(reversible addition fragmentation chain transfer，RAFT)聚合技术。RAFT技术可以在MIP表面上或接近表面的地方直接产生氢键的结合位点，提高了大分子的可及性，因此可在固体载体的表面上制备具有高接枝密度和纳米厚度的MIP薄膜[16-17]。Shao等[18]利用RAFT技术制备了新型核-壳磁性四溴双酚A的分子印迹材料，实现了对有机污染物四溴双酚A的快速富集与分离。Hu等[19]利用RAFT技术制备了分子印迹聚合物涂层硅固相萃取纤维，实现了对辣椒样品中苏丹染料的快速灵敏检测。Lee等[20]利用RAFT技术在碳纳米管表面接枝茶碱印迹聚合物，实现了其对茶碱的特异性结合从而进行监测。张毅等[21]利用RAFT技术制备了分子印迹微球，实现了对恩若沙星及其类似物的特异性吸附，由此可见RAFT聚合在分子印迹领域发挥着重要作用。氧化石墨烯(graphene oxidized，GO)具有超高的比表面积且表面含有大量含氧官能团，已经成为生长金属和金属氧化物纳米粒子的最理想的底物之一，并在使用过程中继续保持这些纳米粒子的稳定性。Fe3O4由于其特有的磁性能被广泛地应用于各种领域，如靶向药物递送，生物成像和传感器[22-25]。但因Fe3O4在空气中容易氧化和高度聚集等问题而常与石墨烯、金属纳米粒子以及导电聚合物等材料杂交[26-27]。

本实验首先通过水热法将Fe3O4负载到片层氧化石墨烯表面形成GO@Fe3O4复合材料，再利用RAFT分子印迹技术，以GO@Fe3O4为载体，17β-雌二醇为模板分子，通过甲基丙烯酸和二乙烯基苯的接枝共聚作用制备磁性氧化石墨烯基17β-雌二醇分子印迹复合膜(GO@Fe3O4-MIP)，实现对水环境中17β-雌二醇分子的快速检测。

1 实验材料与方法

1.1 主要原料

石墨粉，Alfa Aesar公司；浓硫酸(98%)、高锰酸钾(KMnO4)、氯酸钠(NaClO3)、无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津风船化学试剂有限公司；氢氧化钠(NaOH)、三氯化铁(FeCl3·6H2O)，天津市北方天医化学试剂厂；三乙胺、四氢呋喃(THF)、苯基溴化镁(PMB)、二硫化碳(CS2)，百灵威化学技术有限公司；甲基丙烯酸(MAA)，二乙烯基苯(DVB)、偶氮二异丁腈，天津市光复精细化工研究所；氯化亚砜，天津市科密欧化学试剂有限公司；苯，阿拉丁试剂有限公司。

1.2 GO@Fe3O4-MIP的制备

1.2.1 GO@Fe3O4的制备

根据参考文献[28]制备GO。其次取1 g GO于1000 mL二次水中，加入5 g NaOH和5 g NaClO3，超声2 h后静置沉淀，用乙醇清洗4次，真空干燥后获得羧基化的GO(GO-COOH)。将0.8 g GO-COOH，超声分散到50 mL氯化亚砜和25 mL苯的混合体系中，在N2保护下70 ℃回流反应24 h，反应产物依次用THF、乙醇各清洗3次后真空干燥，成功制备酰氯化氧化石墨烯(GO-COCl)。

采用文献[27]的合成方法制备了粒径小于3 nm的羧酸功能化四氧化三铁微球(Fe3O4-COOH)。取0.5 g GO-COCl，超声分散到50 mL DMF中，通氮除氧10 min后，加入20 mL(15 mg/mL)的Fe3O4-COOH水相磁流体和2 mL三乙胺。在50 ℃下反应24 h，外加磁场作用收集产物，产物依次用DMF、乙醇各洗涤3次后，60 ℃下真空干燥，得到磁性氧化石墨烯(GO@Fe3O4)。

1.2.2 GO@Fe3O4-RAFT的制备

GO@Fe3O4-RAFT的制备根据文献[29-30]。0.3 g GO@Fe3O4与5 mL溴代异丁酯溶解于1 mL三乙胺和40 mL甲苯的混合体系中，通N2除O215 min，100 ℃下回流反应24 h后，磁分离收集产物。产物分别经过甲苯、乙醇和乙醚各清洗4次后真空状态下干燥获得溴代化磁性氧化石墨烯(GO@Fe3O4-Br)。

将4 mL的PMB溶解在50 mL的THF中，向混合液中添加2 mL的CS2，在40 ℃油浴中反应2 h后加入0.2 g GO@Fe3O4-Br，通N2除O215 min后，反应体系在密封状态下继续反应24 h。产物分别用二次水、THF、乙醇清洗3次。真空干燥获得RAFT链转移剂(二硫代异丁酸酯)修饰的磁性氧化石墨烯(GO@Fe3O4-RAFT)。

1.2.3 GO@Fe3O4-MIP的制备

分别取100 mg GO@Fe3O4-RAFT，25 mL乙腈，0.136 mg E2，0.30 mL MAA，1.42 mL DVB，25 mg偶氮二异丁腈溶解于三口烧瓶中，通N2除O215 min后，转移至置恒温水浴锅，反应体系在密封状态下反应24 h后，产物用乙腈、乙醇各洗涤3遍，然后用冰乙酸∶乙醇=1∶4的混合溶液索式提取E2，真空干燥得到GO@Fe3O4-MIP。磁性石墨烯非分子印迹膜(GO@Fe3O4-NIP)的制备方法与GO@Fe3O4-MIP相同，只是制备过程中不加入模板E2。

1.3 样品的表征

用D8 DISCOVER X射线衍射仪(XRD)分析晶体结构，用H7650透射电子显微镜(TEM)进行纳米粉体形貌、颗粒尺寸及分布分析，用Agilent-S5500原子力显微镜(AFM)测定样品中的厚度，用S-4800 APOLLO XL特征X射线能谱仪(EDS)测定样品的元素分布。

1.4 GO@Fe3O4-MIP对17β-雌二醇的吸附实验

1.4.1 GO@Fe3O4-MIP的吸附效率-时间曲线

在室温下，将5 mg的GO@Fe3O4-MIP与GO@Fe3O4-NIP分别放入到含有10 mL 0.06 mmol/L的E2水溶液的离心管中，放置在回旋式振荡器上振荡。

在此过程中，经历不同时间后，将样品分别分离出来，利用紫外光谱仪测试不同吸附时间后溶液中E2的含量，根据式(1)计算GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP在不同时间内的吸附效率，绘制出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附效率-时间曲线。

Q=[(C0-Ce)/C0]×100%

(1)

式中：Q为吸附率，%；C0为吸附前样品浓度，即0.06 mmol/L；Ce为吸附后样品浓度，mmol/L。

1.4.2 GO@Fe3O4-MIP的吸附等温曲线

室温下，将5 mg的GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP分别放入到10 mL含有不同浓度的E2水溶液的离心管中，放置在回旋式振荡器上振荡12 h后，在外磁场作用下分离样品。利用紫外光谱仪测试吸附后溶液中E2的含量，根据式(2)计算出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP两种复合材料在不同浓度时的吸附量，绘制出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP两种复合材料随浓度变化的吸附等温线。通过Langmuir线性拟合计算出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP对E2的最大饱和吸附量。

Qeq=(C0-Ce)V/m

(2)

式中：Qeq为吸附量，mg/g；V为样品体积，10 mL;m为吸附剂质量，g。

1.4.3 GO@Fe3O4-MIP的吸附选择性

室温下，将5 mg的GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP分别放入到10 mL 0.06 mmol/L的E2、E3、E1、双酚A 4种不同物质水溶液离心管中，放置在回旋式振荡器上振荡12 h后，在外磁场作用下分离样品。用紫外光谱仪分别测定吸附后4种水溶液中的上述4种物质的含量，根据式(1)计算出两种复合物对4种物质的吸附效率，分析GO@Fe3O4-MIP对E2的吸附选择性。

2 结果与分析

2.1 样品的晶体结构

图1为GO@Fe3O4和GO@Fe3O4-MIP的X射线衍射谱图，2θ在10°～80°范围内进行扫描。从GO@ Fe3O4的XRD图中可以看到，在2θ=30.23°，35.58°，43.22°，57.15°，62.91°处出现Fe3O4晶体结构的特征衍射峰。GO@Fe3O4-MIP的XRD图与GO@Fe3O4的XRD图相互对比分析，依然含有Fe3O4晶体结构的特征衍射峰，这说明在GO@Fe3O4表面上形成的MIP膜并未影响Fe3O4的晶体结构，只是峰强减弱，峰宽变宽。此外，在2θ为18.16°附近，GO@Fe3O4和GO@Fe3O4-MIP的XRD图中均出现了GO的特征衍射峰。

图1 GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP的XRD图谱Fig.1 XRD patterns of GO@Fe3O4 and GO@Fe3O4-MIP

2.2 样品的形貌

图2为Fe3O4-COOH，GO，GO@Fe3O4和GO@Fe3O4-MIP的高倍透射电镜照片。从图2中可以看到，利用FeCl3·6H2O在高温下热解生成Fe3O4，生成的Fe3O4再被聚丙烯酸交联包裹，制备的Fe3O4-COOH纳米粒子为均匀的球形结构，粒径平均在2～3 nm之间，同时，Fe3O4-COOH磁性纳米粒子表面的羧酸基团之间存在静电排斥作用，使其避免了磁性纳米颗粒之间的磁性团聚作用，可以在介质中均匀分散。GO片的厚度非常薄、表面平滑，有部分褶皱和重叠现象，但褶皱和重叠部分依然具有很好的透光率。从GO@Fe3O4的高透射电镜照片中可以清楚地看到，透光率高的、接近透明的载体为氧化石墨烯片，氧化石墨烯载体上面分散着的透光率低的黑色纳米颗粒为Fe3O4-COOH。通过Fe3O4-COOH表面的羧酸功能基团与酰氯化石墨烯结构中酰氯基团之间的酰氯化反应，将粒径均一的Fe3O4负载到GO上，使GO磁性功能化。GO@Fe3O4表面接枝分子印迹膜后，其表面结构发生了明显变化，可以清楚地看到GO@Fe3O4表面平铺了一层透光率低的黑色薄膜，此黑色薄膜使GO@Fe3O4-MIP表面变得平滑，也几乎没有透光性。

图2 Fe3O4-COOH(a),GO(b),GO@Fe3O4(c)和GO@Fe3O4-MIP(d)的TEM图Fig.2 TEM images of Fe3O4-COOH(a),GO(b),GO@Fe3O4(c) and GO@Fe3O4-MIP(d)

2.3 样品的厚度

原子力显微镜能够对物质进行表征分析，观察目标物质的形态结构，图3为GO和GO@Fe3O4-MIP的AFM图。图上显示GO表面均匀平滑，平均厚度约为1.21 nm。GO@Fe3O4-MIP的AFM图上显示MIP接到GO@Fe3O4上，使GO@Fe3O4-MIP表面薄厚不均，凹凸不平，平均厚度约为6.45 nm。根据AFM测试结果可以计算出GO@Fe3O4-MIP上的17β-雌二醇分子印迹膜的厚度约为5.24 nm。

图3 GO(a)和GO@Fe3O4-MIP(b)的AFM图Fig.3 AFM images of GO(a) and GO@Fe3O4-MIP(b)

2.4 EDS能谱分析

图4为GO@Fe3O4-MIP制备过程的EDS能谱图。从图中可以看到GO-COOH的谱图中含有C，O，Na 3种元素，C，O含量相对较高，Na元素来自反应中的氯酸钠和氢氧化钠。GO-COCl与GO-COOH的谱图相比，图中增加了Cl元素，Cl元素来自酰氯化反应的氯化亚砜，Cl元素的出现说明酰氯化反应成功合成了GO-COCl。GO@Fe3O4与GO-COCl的谱图相比，图中Cl元素消失，Fe元素出现，此结果说明通过Fe3O4-COOH表面的羧酸官能团与GO-COCl表面的酰氯基团之间的酰氯化反应，将粒径均匀的Fe3O4-COOH微球成功地负载到GO表面。此外，GO@Fe3O4-MIP复合膜的EDS能谱中出现了S元素，S元素来自于GO@Fe3O4-RAFT结构中的RAFT试剂(二硫代异丁酸酯)，S元素的出现证明了RAFT试剂成功接枝到了GO@Fe3O4表面，并由RAFT试剂控制分子印迹体系的自由基聚合反应，在GO@Fe3O4表面平铺一层17β-雌二醇分子印迹聚合物膜。

图4 GO-COOH(a),GO-COCl(b),GO@Fe3O4(c) and GO@Fe3O4-MIP(d)的EDS能谱图Fig.4 EDS spectra of GO-COOH(a),GO-COCl(b),GO@Fe3O4(c) and GO@Fe3O4-MIP(d)

2.5 振动样品磁强计(VSM)对样品的磁性能分析

Fe3O4-COOH，GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP的磁性能利用VSM分析如图5所示。从图中可以看到Fe3O4-COOH磁化强度为62.91 A·m2·kg-1；GO@Fe3O4的磁化强度为35.15 A·m2·kg-1;GO@ Fe3O4-MIP的磁场感应性由于表面MIP膜的存在，与GO@Fe3O4相比有所降低，磁强度为12.89 A·m2·kg-1，但仍可利用外加磁场从介质中快速有效地分离出来并重复利用。

图5 Fe3O4-COOH，GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP的磁滞回线(插图：利用磁铁将GO@Fe3O4-MIP从介质中分离)Fig.5 VSM curves of Fe3O4-COOH，GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP (illustration:GO@Fe3O4-MIP was separated from the media using a magnet)

2.6 样品的吸附性能分析

2.6.1 吸附效率-时间曲线

图6为GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附效率-时间曲线,从图6中可以看到，开始吸附的15 min内，GO@Fe3O4-MIP对E2的吸附效率明显加快，随着时间的延长，吸附效率的增幅逐渐减慢，到30 min后吸附效率逐渐趋于平衡，GO@Fe3O4-MIP对E2的最大吸附量接近80%，说明GO@Fe3O4-MIP对E2吸附效果显著。在同等条件下GO@Fe3O4-MIP对E2的吸附效率大大高于GO@Fe3O4-NIP。这是因为E2的结构在印迹聚合反应中被“冻结”在GO@Fe3O4-MIP表面的分子印迹聚合物膜中，当洗脱除去E2后，聚合物膜中残留了与其形状相吻合的空穴，其内分布着刚好与E2相匹配的氢键结合位点，能够对E2进行特异性分子识别。而GO@Fe3O4-NIP表面没有形成有效的氢键结合位点，对E2的吸附只是非特异性吸附。

图6 GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附效率-时间曲线Fig.6 Adsorption efficiency-time curves of GO@Fe3O4-MIP and GO@Fe3O4-NIP

2.6.2 吸附等温曲线

图7为GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附等温线，从图7中可以看到，在0.01～0.06 mmol/L的E2浓度范围内，GO@Fe3O4-MIP的吸附量随E2浓度升高而不断增加，当其浓度超过0.06 mmol/L以后，GO@Fe3O4-MIP的吸附量逐渐趋于平衡。在0.01～0.2 mmol/L整个浓度范围，GO@Fe3O4-MIP的吸附量随E2浓度的变化值明显高于GO@Fe3O4-NIP，这表明GO@Fe3O4-MIP对目标分子E2有很强的分子识别能力。这一现象可以通过GO@Fe3O4-MIP聚合过程及表面结构进行分析：GO@Fe3O4表面接枝了大量的RAFT试剂，RAFT试剂有效地控制了E2，MAA，DVB在GO@Fe3O4表面所进行的自由基聚合反应，使GO@Fe3O4表面平铺了一层MIP膜。因为聚合过程中是以E2为目标分子，在GO@Fe3O4-MIP复合膜表面形成了与E2大小适宜的孔状结构，其中氢键键合位点可以与E2进行专一性表面识别结合，其最大吸附量能达到28.62 mg/g。然而，GO@Fe3O4-NIP的聚合过程中，缺少目标分子E2，GO@Fe3O4-NIP表面不存在有效印迹位点，与E2的氢键键合作用较弱，不能选择性地与E2进行键合，吸附作用类型属于非特异性吸附，它的最大吸附量为9.63 mg/g。

图7 GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附等温线Fig.7 Adsorption isotherm of GO@Fe3O4-MIP and GO@Fe3O4-NIP

2.6.3 吸附选择性

从图8中看出GO@Fe3O4-MIP复合膜对E2的选择性吸附率明显高于E3,E1,双酚A(BPA)3种竞争分子。同样条件下，对E3，E1，BPA3种竞争分子的吸附效率则相差无几，分别为36.27%，25.83%，22.94%。而GO@Fe3O4-NIP复合膜对4种物质的吸附效率明显低于GO@Fe3O4-MIP复合膜，对4种物质的吸附率相差不大。此结果进一步验证了GO@Fe3O4-MIP复合膜对于E2具有特异性分子识别能力。

图8 GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附选择性Fig.8 Adsorption selectivity of GO@Fe3O4-MIP and GO@Fe3O4-NIP

3 结论

(1)选择GO@Fe3O4为载体，E2为模板分子，采用RAFT分子印迹聚合法成功制备了GO@Fe3O4-MIP复合膜，并研究了GO@Fe3O4-MIP对E2的吸附性能。

(2)GO@Fe3O4-MIP在开始吸附的15 min内对E2的吸附效率明显加快，到30 min后吸附效率逐渐趋于平衡，最大吸附量接近80%，通过Langmuir线性拟合计算出最大饱和吸附量为28.62 mg/g。

(3)0.01～0.2 mmol/L整个浓度范围内，GO@Fe3O4-MIP对E2的饱和吸附浓度为0.06 mmol/L；吸附选择性性能实验表明GO@Fe3O4-MIP对E2具有专一的特异性识别能力。说明GO@Fe3O4-MIP在复杂水体环境中能快速有效地实时检测E2。