烟草幼苗中烟碱转化株的快速筛选

李 勇，逄 涛，陈学军，师君丽，隋学艺，顾华国

云南省烟草农业科学研究院，云南省玉溪市南祥路14 号 653100

烟碱是栽培烟草（Nicotiana tabacum）的主要生物碱，约占栽培烟草生物碱总量的95%［1］。降烟碱是烟碱的去甲基化产物，在栽培烟草中含量较少，但在其祖先种绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）［2］和 林 烟 草（Nicotiana sylvestris）［3］中含量较高，是这些烟草的主要生物碱。Siminszky 等［4］证实了烟碱向降烟碱的转化由名为CYP82E47 的细胞色素P450 单氧化酶调节，而CYP82E47 则受叶片老化相关信号通道调节［5］。在栽培烟草中，烟碱向降烟碱的转化主要发生在烟叶衰老和调制过程中。栽培烟草中可将大部分烟碱转化为降烟碱的突变植株被称为“转化株”［6］。白肋烟和烤烟中关于转化株的报道很多［7-8］。转化株中烟碱含量很低，而降烟碱、N-亚硝基降烟碱（N-nitrosonornicotine，NNN）［9］和麦斯明［10-11］等含量则成倍上升，该变化可导致转化株烟叶的评吸质量降低，致癌风险上升。在白肋烟群体中，最多可出现20%的转化株［4］。烤烟转化株被称为“硃砂烟”或“樱红烟”［12］，烤烟群体中转化株比例约为0.6%［13］。与白肋烟相比，正常烤烟的NNN 含量较低（约为白肋烟的1%或更少），故烤烟转化株中的NNN 浓度远低于白肋烟和白肋烟转化株。

从栽培烟草群体中识别和去除转化株有利于保障生产烟叶的品质稳定。转化株鉴别一般采用乙烯、乙烯利、碳酸氢钠等激化剂促进转化株的烟碱在较短时间内大量向降烟碱转化，再通过测定烟碱和降烟碱的含量对转化株进行判别［14-15］。然而这些方法多侧重于检测大田烟株，且鉴定通常需要几天时间。从苗盘幼苗中快速筛除转化株相比大田期筛除更为高效，但目前相关方法还未见报道。为此，本研究中拟通过对烟草幼苗期转化株和非转化株生物碱含量特征的研究，旨在建立一种对苗盘幼苗烟草转化株的快速鉴定方法。

1 材料和方法

1.1 育苗和采样

将云烟85（烤烟）、云烟85 转化株（烤烟）、TN90（白肋烟）和克撒锡巴斯玛（香料烟）等烟草种子播种在温室中各自的苗盘（9×18 孔，孔径：3 cm×3 cm）内。播种后第45～55 d 进行取样。对于每一株幼苗，取其最大叶片（长宽乘积大于40 cm2）。将采集的叶片沿主脉对折，然后再对折。采用直径为6 mm 的打孔器在折后烟叶上进行3 次打孔（打孔时尽量使3 个孔在折后烟叶上分布均匀），收集12 个直径为6 mm 的圆形叶块，放入1.5 mL塑料离心管中。采集的样品可直接进行溶剂提取或在37 ℃下孵化12 h 后进行溶剂提取。为防止种子自然突变现象对实验的影响，所有实验烟苗均采用基于Shi 方法［14］的程序进行孵化，即样品在37 ℃和80%相对湿度下孵育7 d，然后取出进行分析，确定其是否为转化株。

1.2 生物碱提取

采用甲基叔丁基醚（Methyl tert-butyl ether，MTBE）作提取剂，喹啉作内标。每个幼苗样品中同时加入0.3 mL 喹啉溶液（溶剂为MTBE）和0.5 mL 2.5%（质量分数）的氢氧化钠溶液，涡旋1 min，萃取液静置分层，取150 μL 上清液转移至气相色谱自动进样器进样小瓶进行仪器分析。

1.3 仪器分析

采用Agilent 7890A 气相色谱仪（美国Agilent公司）与5977B 质谱仪进行分析。色谱柱为DB-5 MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。分流比为20∶1，进样量为2 μL。分离温度为270 ℃恒温，分离时间为1.8 min，每个样品仪器总运行时间约3.5 min。载气（氦气）流量为1.0 mL/min。采用选择离子模式（SIM）进行数据采集。烟碱、降烟碱和喹啉的分析离子分别设为84、70 和129。采用电子轰击（EI）模式电离，电离电压为70 eV，检测器电压为1.0 kV。离子源和传输线温度分别保持在200 ℃和300 ℃。

1.4 数据分析

使用Agilent MSD ChemStation F.01.03.2357 化学工作站对所有样品和标准品进行自动峰识别和积分。手动检查积分错误并在必要时重新积分。用于校正曲线的烟碱和降烟碱的浓度范围分别为0.78～50.00 μg/mL 和0.15～10.00 μg/mL。内标（喹啉）浓度为1.0 μg/mL。使用MSD 化学工作站完成定量校准，并将所得数据转移到Excel 软件中进行进一步分析。用烟碱转化百分比（Percent nicotine conversion，PNC）区分转化株和非转化株。PNC 定义为降烟碱浓度（mol/L）除以烟碱和降烟碱总浓度（mol/L）的商。为简化筛选转化株的流程，本实验中还定义了拟PNC（Pseudo percent nicotine conversion，PPNC）。PPNC 定义为降烟碱峰面积除以烟碱和降烟碱总峰面积的商。使用PPNC 时无需使用烟碱和降烟碱的标准品，也无需绘制标准曲线。实验中涉及的烟叶质量均为鲜烟叶的质量。

2 结果与分析

2.1 采样稳定性实验

为实现转化株的快速筛选，本实验中在采样时省略了称样步骤。评价了所采样品质量的稳定性（表1），发现不同烟叶10 个样品之间的质量相对标准偏差在4.1%～4.8%之间，表明所使用的采样方法可以采集质量较为稳定的样品。其原因可能为苗盘烟苗所处的生长环境几乎完全相同，所采叶片具有相似的厚度和密度。样品质量的稳定性确保了所计算的PNC 或PPNC 的可比性。由于大田烟叶所处生长环境差异较大，如采用本实验使用的方法采样可能导致不同样本间的质量差异较大。但由于PNC 或PPNC 的计算与采样质量无关，只要烟碱和降烟碱的浓度处于仪器的线性响应范围，采样质量的差异不会对PNC 和PPNC 的计算值产生影响。

表1 打孔器取样获得样品的质量分布Tab.1 Weight distribution of samples obtained by using hole punchers

2.2 叶片上采样位置对分析结果的影响

为实现转化株的快速筛选，本实验中从幼苗叶片中收集12 个叶块作为一个样品，而不是把整片叶子或整个植物作为样本采集。实验结果（表2）表明，烟碱和降烟碱在幼苗叶边缘的含量高于中间。而PNC 和PPNC 值在边缘和中间采样间无显著差异。这表明叶片上的采样位置对PNC 和PPNC 值影响不大。但仍建议对每片叶子进行固定位置采样，在本实验中对对折后烟叶进行打孔时，尽量使3 次打孔均匀分布于烟叶表面。

表2 叶面采样位置对PNC 和PPNC 的影响①Tab.2 Influences of leaf sampling position on PNC and PPNC

2.3 叶片大小对分析结果的影响

对比分析了大叶采样和小叶采样对PNC 和PPNC 的影响（表3）。结果发现，烟碱和降烟碱的含量在大叶和小叶之间没有显著差异，PNC 和PPNC 的差异也不明显。考虑到对太小的烟叶采样时操作较困难，建议选择长宽积超过40 cm2的叶片进行采样。

表3 叶面尺寸对PNC 和PPNC 的影响Tab.3 Influences of leaf size on PNC and PPNC

2.4 PNC 在未孵化幼苗中的分布

在不进行孵化培养的情况下直接测定转化株和非转化株中烟碱和降烟碱的含量并计算PNC。结果显示，烤烟转化株的烟碱含量低于非转化株，而降烟碱的含量则高于非转化株（表4）。这意味着在幼苗期，转化株中的烟碱就已经开始向降烟碱转化。对221 株烤烟转化株和非转化株群体进行分析，发现转化株的PNC 均值为其非转化株的4倍。这种差异表明可通过PNC 对幼苗转化株进行区分。通过对转化株和非转化株中PNC 的分布（图1b）进行研究发现，以PNC 值5%作筛选和去除转化株的判断点时，可以在损失7%的非转化株的情况下去除99%的转化株；以PNC 值4%作判断点时，可以在损失21%的非转化株的前提下完全去除转化株。该方法虽有部分非转化株损失，但可实现转化株的快速筛除。

根据文献［4，15］，白肋烟和香料烟群体中转化株的最高比例分别可达20%和10%。由于未获得白肋烟和香料烟的转化株种子，本研究中尝试使用Shi 等的方法［14］从这两个品种的幼苗中筛选出转化株作为实验对象，但未成功。将白肋烟和香料烟的非转化株与烤烟非转化株进行比较（表4），发现白肋烟非转化株与烤烟非转化株具有相似的烟碱和降烟碱含量，因而其PNC 值也很接近。香料烟非转化株的烟碱含量比烤烟非转化株低，但降烟碱含量相当，因此导致香料烟非转化株的PNC 值整体大于白肋烟和烤烟。预计白肋烟转化株的PNC 值分布与烤烟转化株相似，但这种推测需通过较大样本量的白肋烟转化株进行验证。

2.5 PPNC 的使用

由于PNC 是根据烟碱和降烟碱的绝对定量计算得出的，PNC 的值受标准品纯度和校准曲线质量的影响。为简化判别并消除潜在误差，本实验中定义了PPNC。对PNC 和PPNC 进行线性拟合，发现两者存在显著的线性相关（R2=0.996 8，图1a）。比较PNC 和PPNC 对烤烟转化株和非转化株群体（转化株和非转化株分别为106 株和154株）的区分，发现转化株的PNC 和PPNC 分别为非转化株的3.8 倍和4.5 倍（表4）。进一步考察两者对转化株的区分效果（图1b、图1c），发现根据PPNC 值0.9%对转化株进行筛选，可在损失8%非转化株的情况下实现转化株的完全剔除。而采用PNC 值进行判别时，要达到转化株的完全剔除，需损失21%的非转化株。因此，本研究中PPNC 的计算比PNC 更简单，且用于转化株筛除时效果更佳。

图1 PNC 和PPNC 之间的相关关系以及两者在转化株和非转化株中的数值分布Fig.1 Distribution and correlation of PNC and PPNC in converters and non-converters

表4 转化株和非转化株的PNC 和PPNC 值分布Tab.4 Distribution of PNC and PPNC in converters and non-converters

2.6 孵化烟叶以实现转化株和非转化株的完全分离

从烤烟群体中转化株（106 株）和非转化株（154 株）的PNC 分布可知，即使两者的PNC 均值差异很大，转化株和非转化株群体之间仍存在PNC 或PPNC 重叠的现象（图1b、图1c）。采用未孵化烟叶的PNC 或PPNC 进行转化株的筛选时，要么需损失筛选的准确性，要么需损失部分非转化株烟苗。而文献报道的转化株筛选方法，均采用激化剂（乙烯、乙烯利或碳酸氢钠）对烟苗进行孵化培养，以扩大转化株和非转化株之间的PNC 差异［14-15］。这些方法均需在合适激化剂存在并控制温度和湿度培养几天方可实现。本实验中发现，在37 ℃下孵化所采集的烟叶样品（密封于1.5 mL离心管中）12 h 后，转化株的PNC 和PPNC 分别增加了3.1 倍和3.7 倍，而非转化株的PNC 和PPNC 均没有显著变化（图2a、图2b）。孵化实验促进了转化株中烟碱向降烟碱的转化，使得转化株群体和非转化株群体的PNC 或PPNC 不再有重叠（图2c、图2d）。因此，如果不要求对转化株进行现场即时筛选，可将所采集的样品在37 ℃下培育12 h 后再进行溶剂提取和仪器分析。

图2 孵化对区分转化株和非转化株的影响Fig.2 Influences of incubation on discrimination of converters and non-converters

3 讨论

Shi 等［14］优化了转化株的孵化条件（包括温度、相对湿度和激化剂），以实现烟碱的最大转化，然后根据最大转化率筛选转化株。该方法中孵化反应耗时4～6 d，测定烟碱和降烟碱的含量再需几个小时，虽然有效但较为费时，故不太适合大规模烟株样本的筛查。本实验中发现，未经孵化培养的幼苗转化株的平均PNC 和PPNC 分别为非转化株的3.8 和4.5 倍。采用PPNC 进行筛查时可在只损失8%非转化株的前提下实现转化株的完全剔除。因此，如需快速筛查，可采用不孵化培养的方式进行筛选。

本实验中简化了烟碱和降烟碱的测定方法，取消样品研磨和称样步骤，缩短了样品提取时间，优化了气质联用分析方法（采用270 ℃恒温模式而不是程序升温），最终使得整个鉴定过程只需5～6 min（图3，方法A）。若需完全分离转化株和非转化株，只需要在样品提取之前将采集的样品在37 ℃下孵育12 h 即可（图3，方法B）。此外，本实验中引入了PPNC 作为PNC 的简化方案。PPNC 比PNC 更容易获得，且不受标准品纯度、标准曲线质量等因素影响，一定程度上比PNC 具有更好的筛选效果。

图3 直接鉴定烟碱转化株（方法A）和孵育后鉴定转化株（方法B）的流程图Fig.3 Flow charts of direct identification of nicotine converters（A）and identification after incubation（B）

文献［14］中使用了包括乙烯，乙烯利和碳酸氢钠等刺激剂促进烟碱转化，而碳酸钠被认为与乙烯和乙烯利具有相同的刺激效果。本实验中比较了使用和不使用0.8%碳酸氢钠处理的转化株幼苗，发现2 种处理的PNC 无明显差异，这可能与本实验在封闭系统里进行孵化处理有关。因此，本实验中在进行孵化培养时无需外加激化剂。

根据Shi 等［14］的方法，为实现烟碱的最大转化需控制相对湿度，适当的湿度可确保转化相关酶的活性。本实验中将叶片样品密封在1.5 mL 离心管中进行孵育，叶片的水分被封锁在离心管中，因此无需提供额外的环境湿度。采用这种方法，转化株的PNC 和PPNC 分别增加了3.1 倍和3.7 倍（图2a、图2b），而非转化株则没有变化。由于本实验中无需额外控制孵化反应的湿度，简化了反应条件，使得孵化反应可在任何温度可控的环境下进行。

4 结论

本研究中建立了一种快速鉴定烟草幼苗群体中烟碱转化株的方法，该方法采用打孔器取样，样品无需研磨，直接提取（或密封培养后提取）后进行气相色谱-质谱快速分析，可在几分钟或十几个小时内完成转化株的筛除，为大批量快速筛查烟草幼苗中的烟碱转化株提供了技术方案。