新余蜜桔自然四倍体叶片形态与生理特异性分析

王雨亭，万水林，闫承璞，胡钟东，汤雨晴

(江西省农业科学院园艺研究所，南昌，330200)

新余蜜桔是江西省继南丰蜜桔和赣南脐橙之后又一极具特色的地方果树优良品种，其果实外观鲜艳，果实味甜，果肉细嫩且化渣性好，但果实有籽成为其发展的最大障碍之一[1]。一般情况下，三倍体果实具有无核或少核的特征，且抗性强，因此获得三倍体是柑桔无核育种的重要途径之一。目前培育三倍体最经典、最有效的育种途径是以单胚性二倍体品种为母本与四倍体材料进行杂交，同时结合胚抢救获得三倍体植株[2]。与较容易获得的二倍体相比较，四倍体资源对于无核育种更为迫切。

很多学者对四倍体亦开展了较多研究。如：沙田柚与宜昌橙异源四倍体植株的叶片颜色比二倍体明显更深、叶片更厚，花器官也变大[3]。刘庆忠等[4]通过切片观察发现，皇家嘎啦苹果同源四倍体叶片的栅栏组织和海绵组织厚度均比二倍体显著增加。Allario等[5]在柠檬同源四倍体叶片中也发现类似的结果。Beaulieu等[6]发现被子植物基因组的大小与保卫细胞长度及表皮细胞面积呈显著正相关，与气孔密度呈显著负相关，认为多倍体通过提高细胞核DNA含量，增大细胞体积，可获得更大的营养器官。Tan等[7]比较研究了资阳香橙(CitrusjunosSieb. ex Tanaka)双二倍体和二倍体叶片在初生及次生代谢物方面的差异，发现双二倍体叶片中与胁迫相关的初生代谢物和基因均显著上调，而黄酮类等次生代谢物和相关基因均被抑制。谭丰全等[8]基于代谢组学研究发现，相比“鄂柑1号”(CitrusreticulataBlanco)二倍体亲本，其双二倍体通过抑制成熟后期柠檬酸的降解和利用，促使其果实积累了更多的柠檬酸。可见，植物染色体加倍后，通常会引起生物学性状、代谢物及基因表达等多方面发生变化。

随着细胞融合技术的发展，世界范围内获得了大量的异源四倍体细胞杂种，且已经被用于无核育种中。Grosser等[9]利用柑桔异源四倍体体细胞与二倍体杂交获得了12 000株三倍体。解凯东等[10,11]经过多年研究，利用创制的柑桔四倍体体细胞杂种，与二倍体杂交累计获得三倍体株系1 156株，这些三倍体还在进一步研究中。同时，倍性育种培育的三倍体会因为亲本选择不同而表现出不同的性状。如：以“Sugar Belle”为母本获得的三倍体表现出结果早、枝刺短等优良性状，而以单胚的“克里曼丁桔”为母本获得的三倍体后代表现出结果晚、枝刺长等特点[9]。可见，杂交亲本的选择直接影响了后代农艺性状的优劣。因此，为了提高育种效率，有必要对获得的四倍体材料进行初步评价，并明确其优良农艺性状，以期更好地将其应用于无核育种中。

笔者在前期研究中发现了一株自然变异的新余蜜桔四倍体(4x)材料，且已进入结果期，观察分析其生物学特性及农艺性状，对于培育新余蜜桔无核品种，创制柑桔新型种质，具有至关重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料笔者2015年在本单位试验基地7年生新余蜜桔园内发现了一个自然变异的单株，随机取该植株上的叶片，经流式细胞仪(Partec CyFlowspace, Germany)检测，证实该植株为四倍体，检测结果见图1，以下将该植株命名为“新余蜜桔自然4x”。2016年从该植株上采集接穗高位嫁接于新余蜜桔二倍体(2x)植株上。本试验所取叶片均为高位嫁接的新余蜜桔自然4x叶片及该植株上相同方位的2x叶片。每个植株取当年生营养春梢顶端以下第4—6片叶(取样日期为2019年5月31日)，每3个枝条为1个重复，共3个重复[8]。新余蜜桔自然4x和2x叶片样品及田间枝梢的比较见图2。

图1 新余蜜桔二倍体(2x)与自然四倍体(4x)混合叶片样品流式细胞仪倍性检测结果

注：叶片样品于2019年5月31日采集；黑色框内为高接新余蜜桔自然4x枝梢，其余为2x枝梢。

1.2 叶片形态学特征测定与观察每种材料取10片叶，用电子千分尺测定叶片长度和宽度，计算叶形指数，同时测定叶片厚度。

石蜡切片取样选择叶片中间部位主叶脉一侧且避开侧叶脉处。用FAA固定液(福尔马林5 mL + 乙酸5 mL + 70%乙醇90 mL)固定样品1周，脱水，透明后石蜡包埋，切片，脱蜡，复水等。本研究采用甲苯胺蓝染色法观察叶肉细胞结构。

利用扫描电镜观察叶片气孔形态[12]。样品在流动水下冲干净，吸干水分后置于4%戊二醛溶液固定，0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，4 ℃过夜，无水乙醇梯度脱水30 min，临界点干燥，镀金等，最后于日立SU8010扫描电镜(加速电压5 kV)下观察。

1.3 相关生理生化指标测定叶绿素含量，光合作用关键酶二磷酸核酮糖羧化酶(加氧酶，Rubisco)及丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)活性，总酚、木质素及脯氨酸含量的测定，均采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒。叶绿素用80%丙酮溶解，提取，在波长665和649 nm下测定吸光度。Rubisco活性通过测定波长340 nm下还原型辅酶I(NADH)的氧化速率来反应，PPDK活性通过测定波长340 nm下还原型辅酶I的减少率来计算。酚类物质与钨钼酸发生还原反应，产生的蓝色化合物在760 nm处有特征吸收峰，通过测定吸光值计算总酚含量。木质素中的酚羟基发生乙酰化后在280 nm处有特征吸收峰，通过测定吸光值计算木质素含量。利用磺基水杨酸提取脯氨酸，脯氨酸与酸性茚三酮溶液反应生成红色物质，加甲苯萃取后，在520 nm处有特征吸收峰，通过测定吸光值计算脯氨酸含量。

1.4 叶片内源激素含量测定选取新余蜜桔自然4x和2x叶片材料(2019年5月31日取样)，每株同一方位采集春梢下第4—5片叶，制备混合样。样品用研磨仪(MM 400，Retsch)研磨至粉末状，称取50 mg样本，用甲醇∶水∶甲酸 = 15∶4∶1(体积比)进行提取，复溶，过0.22 μm PTFE滤膜，置于进样瓶中，用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)仪进行分析。液相色谱条件主要包括：色谱柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相：超纯水，乙腈(加入0.05%的甲酸)。质谱条件：电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度500 ℃，质谱电压4 500 V，帘气(curtain gas，CUR)241.325 kPa(35 psi)，碰撞诱导电离 (collision-activated dissociation，CAD)参数设置为medium。

1.5 数据处理数据结果均为3次生物学重复的平均值±标准误差。采用Excel软件对数据进行统计分析及做图，采用T检验分析4x和2x之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 叶片形态特征新余蜜桔自然4x与2x叶片均成卵圆形。相比新余蜜桔2x，新余蜜桔自然4x叶片叶形指数显著降低，且厚度显著增加，其中，叶形指数降低52.47%，叶片厚度增加33.42%(见表1)。新余蜜桔自然4x的叶片显得更宽大，更厚重。

表1 新余蜜桔自然4x与2x叶形指数和叶片厚度对比

2.2 叶片组织细胞结构石蜡切片观察发现，新余蜜桔自然4x叶片的细胞显著大于新余蜜桔2x(图3)。扫描电镜观测发现，新余蜜桔自然4x叶片气孔器密度减小，但气孔开口变大(图4)。

图4 新余蜜桔自然4x与2x叶片气孔器形态比较(扫描电镜)

2.3 叶片主要生理生化特征新余蜜桔自然4x叶片的全碳和全氮含量与2x无显著性差异，叶片蛋白质总含量显著高于2x，此外，叶绿素a、叶绿素b含量及叶绿素总含量分别比2x高8.4%、55.3%和54.6%；但是，光合作用2个关键酶Rubisco和 PPDK的活性与2x相比显著降低，分别降低28.3%及22.35%。与2x相比，新余蜜桔自然4x叶片的木质素及总酚含量分别显著高出23.0%和12.6%，表现出较高的抗逆性潜能，而脯氨酸含量差异不显著(见表2)。

表2 新余蜜桔自然4x与2x叶片主要生理生化特征对比

注：石蜡切片，放大100倍观察。

2.4 叶片内源激素试验检测了5大类24种内源激素，其中15种激素低于检测阈值，其余9种激素在叶片中的含量如表3所示。新余蜜桔自然4x叶片内源吲哚乙酸(IAA)及异戊烯基腺嘌呤(IP)含量均高于2x叶片，这两种激素均与植物细胞分裂有关，而且IP参与植物叶绿素的合成。此外，新余蜜桔自然4x叶片内源脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)含量也显著高于2x叶片，而这两种激素均与植物抗逆性密切相关。

表3 新余蜜桔4x与2x叶片部分内源激素含量(以鲜质量计) ng/g

3 讨论

叶片组织结构在一定程度上能够反映植物的生理适应性，可将植物叶片组织结构作为种质资源评价、育种和抗逆性研究的重要依据[13]。

3.1 多倍体组织形态学特征一般情况下，多倍体植株普遍比二倍体拥有更大的器官。如：沙田柚与宜昌橙的异源四倍体比二倍体的叶片更厚，而且花器官更大[3]；柠檬同源四倍体叶片的栅栏组织和海绵组织变大，叶片变大，且叶片含水量增加[5]；资阳香橙四倍体的叶片比二倍体大且厚，同时叶片气孔变大，但气孔密度变低[6]；多倍体枇杷的叶片相比二倍体也表现出更宽、更厚的特征[14]；拟南芥同源四倍体与二倍体的成熟胚和子叶的细胞数目无差异，但四倍体的细胞显著增大[15]。本试验中，新余蜜桔自然4x叶片与2x相比表现出更宽、更厚的特征，同时叶肉细胞变大，与前人研究结果较为一致。由此推测，新余蜜桔自然4x叶片变大的原因可能是叶肉细胞变大所致。

此外，有研究在转基因烟草中发现，随着内源激素IAA水平升高，烟草叶片气孔密度减小，保卫细胞长度增加，栅栏组织细胞增大，同时叶片厚度增加[16]。本试验结果显示，新余蜜桔自然4x叶片除了变宽变厚、气孔变大之外，其内源IAA及IP含量显著高于2x。由此推测，新余蜜桔自然4x叶片可能通过增加内源激素IAA及IP的合成代谢刺激叶肉细胞增大，从而引起叶片变厚，叶形指数变小。

3.2 多倍体光合作用特征叶绿素含量高低直接影响植物的光合效率。很多研究表明，植物叶片叶绿素含量与倍性关系密切。如：四倍体葡萄叶片的叶绿素含量显著高于二倍体叶片[17]，枇杷三倍体和四倍体叶片的叶绿素含量均高于二倍体[14]，而白菜多倍体叶片叶绿体含量与二倍体的差异不显著[18-19]。本试验中出现了类似情况，与新余蜜桔2x叶片相比，新余蜜桔自然4x叶片的叶绿素含量显著升高。但是，本试验测定的2个光合作用关键酶Rubisco及PPDK的活性，新余蜜桔自然4x相比新余蜜桔2x有所降低。新余蜜桔自然4x与2x叶片光合作用的差异及其机理还有待进一步研究。

3.3 多倍体抗逆性特征果树多倍体是重要的抗逆种质资源，普遍具有良好的抗逆性，对环境有更强的适应性。如：苹果同源四倍体在应对干旱和盐胁迫时，表现出比二倍体更强的耐胁迫能力[20-21]；两个苹果品种“富寒”和“Gala”的同源四倍体和二倍体在盐胁迫处理后，四倍体表现出更强的盐胁迫适应能力[22]，并且该耐盐胁迫品种的四倍体还表现出更强的抗旱能力[21]；四倍体来檬在抗旱方面显著优于其二倍体，究其原因，四倍体来檬根系合成ABA的能力增强[5]。研究表明，多倍体植物可以通过调整细胞内源激素等变化增强其抗逆性[23]。本试验发现，新余蜜桔自然4x叶片中与植物抗性密切相关的总酚和木质素含量，与抗旱性相关的激素ABA含量，与抵抗病原菌侵染密切相关的激素JA含量等均显著高于2x，理论上该自然四倍体具有良好的抗性。近年来当地未有逆境自然条件出现，该自然4x的抗逆性未能得到印证，但从长势来看，新余蜜桔自然4x的长势更强、更旺。因此，在后续研究中，应进一步开展新余蜜桔自然4x的抗逆性试验，充分挖掘和掌握该资源的性状特点，为今后开展有针对性的倍性育种探明方向。此外，新余蜜桔自然4x叶片中与抗逆相关的其他初生及次生代谢物和基因表达是否也发生相应变化，还有待深入研究[7]。

综上所述，新余蜜桔自然4x可能具有更强的光合作用和抗逆性，可以为新余蜜桔和其他柑桔品种的无核选育提供良好的亲本材料及理论参考。