沙田柚黄龙病近红外光谱检测研究

刘福平，王 茜，陈东奎，廖惠红，黄宏明，张尧良，黄其椿，汪妮娜，张 兰，董伯年，何东模，施平丽

(1 广西壮族自治区农业科学院园艺研究所/农业部南宁南亚热带果树科学观测实验站/广西柑桔黄龙病防控工程技术研究中心，南宁，530007；2 广西壮族自治区容县农业科学研究所，广西容县，537500)

沙田柚是我国柚类优良品种之一[1]，果大形美，风味佳，耐贮藏[2]，在广西、广东、湖南、四川、浙江和江西均有种植[3]，以容县沙田柚和梅州金柚最为有名。容县是沙田柚原产地，被称为“中国沙田柚之乡”，容县沙田柚也是地理标志产品[4]。截至2019年，容县沙田柚种植面积达1.4 万hm2(21万亩)，产量达22万t，全县15个镇都有种植。近年来，柑桔黄龙病已成为影响沙田柚品质和产量的重要因素之一[5]。感染柑桔黄龙病后，沙田柚会出现“黄梢”和斑驳黄化叶，病叶容易脱落，病果变小、畸形、着色不均匀[6]，随着发病程度加深，果实品质下降，酸度和异味度显著提高，失去食用价值，其经济价值受到严重影响[7]。目前柑桔黄龙病依然无有效防治药剂，有效防控措施是清除病源和切断传播媒介。因此，探究快速、髙效、便携、适合大规模使用的田间诊断技术，对柑桔黄龙病的流行预警和及时防控具有重要的生产意义[8]。基于近红外技术的柑桔黄龙病田间快速检测方法，具有快速、安全、无损等优点[9]。前人针对沙糖桔、脐橙、沃柑、温州蜜柑等品种，采集叶片近红外光谱，建立标准数据库模型并验证，证明了利用近红外光谱检测柑桔黄龙病的可行性[8,10-12]。广州讯动网络有限公司开发了手持近红外光谱检测仪，使用其已建立好的沙糖桔黄龙病识别模型对沙田柚黄龙病疑似样品进行检测，检测结果以Nested-PCR检测结果为参照，准确率低于该模型自身识别率。推测是由不同品种柑桔叶片的近红外光谱存在差异所致[8]。

笔者从容县各乡镇采集沙田柚样品，以Nested-PCR检测结果为参照，采用手持式近红外光谱仪开展沙田柚黄龙病的检测研究，旨在探索沙田柚黄龙病简便、准确的田间快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

沙田柚样品采自容县容州镇、自良镇、县底镇、十里镇、六王镇、浪水镇、松山镇、石寨镇等果园。采样时间分两批，第一批采样时间为2019年2月，第二批采样时间为2019年11月。样品类型包括无症状叶、斑驳黄化叶、均匀黄化叶(主要为黄梢黄化叶)、缺素黄化叶(主要为缺镁)、其他黄化叶(主要为烂根、损伤导致的黄化叶)，共305株树，590份样品。

1.2 仪器设备

光谱仪器使用广州讯动网络有限公司开发的手持近红外光谱检测仪，采用NGD-HL11模块，该模块采用最新的MEMS微镜技术原理，波长范围950～1 650 nm。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 采集不同果园的叶片样品。按照果园、树、症状进行分区、编号和分类，采集的叶片样品要求有代表性。一株树从不同方位采集症状一致的5张叶片归为一个样品。

1.3.2 样品处理与保存 清洗并擦干样品叶片，使其干净、无污渍，4 ℃冷藏暂存，采集完光谱的样品转入-40 ℃低温冰箱保存。

1.3.3 光谱采集 每片叶采集基部、中部、尾部主叶脉附近3个点，避开支叶脉位置，5片叶共采集15条光谱。

1.3.4 样品Nested-PCR检测 取叶片主叶脉每份100 mg，用液氮研磨至粉末状，放-20 ℃保存待用。采用天根生化科技(北京)有限公司快捷型植物基因组DNA提取系统提取DNA[13]，采用黄龙病亚洲种16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2进行Nested-PCR扩增，PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测后拍照[14]。

1.3.5 建模及验证 采用2019年11月收集的307份样品，共4 593条近红外光谱(因剔除了明显错误的光谱，故实际利用光谱数少于原采集光谱数，下同)，以黄龙病亚洲种Nested-PCR检测结果为参照，利用标准正态变量分布(SNV)预处理[10]，在一定程度上减少温度、水分等因素对叶片光谱的干扰，然后采取偏最小二乘法识别分析(PLS-DA)[12]，将样品划分为建模集和检验样品集，建模集用于确定近红外定量模型的参数，然后采用不参与建模过程的检验样品集对优选的模型进行检验[10]。根据模型的可用性来评价模型预测未知样品的能力，本研究采用的评价指标为识别率。识别率(%)=(预测准确的近红外光谱数/总近红外光谱数)×100。

1.3.6 不同时间样品验证 采用2019年2月283份样品的4 147条近红外光谱作为验证集，以Nested-PCR检测结果为参照，进行模型验证。

2 结果与分析

2.1 样品采集情况

采集的样品分别来自轻度感病(柑桔黄龙病)、中度感病、重度感病的沙田柚树以及未感病但有其他黄化症状的沙田柚树。秋季，轻度感病沙田柚树，一般在树的中上部出现一枝到多枝黄梢，黄梢基部叶片出现斑驳黄化，大部分果实大小、形状与正常果无差异，水分较少，品尝后先甜后苦，或出现个别畸形小果，小果的结果枝叶片黄化，但不表现斑驳症状。中度感病沙田柚树，部分大枝会表现症状，老叶斑驳黄化，表现症状的大枝长势明显衰退，果实变小，水分变少，入口即有苦味，回酸，但其他未表现症状的大枝，果实大小与正常果差异较小，略有苦味。重度感病沙田柚树，整株树严重衰退，大部分老叶明显斑驳，叶片变小、变脆，易脱落，果实全部变小，有酸味和异味，失去食用价值。春季，由于树体恢复生长，感染黄龙病的树整体会返绿，叶片斑驳症状较不明显，但是中度感病和重度感病的沙田柚花苞多，多出现畸形花，新梢少，老叶叶片较少，易脱落。其他采样沙田柚树包括表现为缺素(主要为缺镁)的黄化树和烂根、损伤造成的黄化树。

2.2 近红外光谱建模情况

2019年11月采集的307份样品近红外光谱建立的标准数据库模型总识别率81.75%，阳性样品识别率83.41%，阴性样品识别率78.80%，假阳性率7.62%，假阴性率10.62%(见表1)。其中，不同症状样品总识别率从高到低依次为斑驳黄化叶96.72%>缺素黄化叶79.67%>无症状叶71.57%>均匀黄化叶65.06%>其他黄化叶53.64%；均匀黄化叶和其他黄化叶阴性样品识别率较低，分别为45.03%和41.38%，即均匀黄化叶阴性样品有54.97%、其他黄化叶阴性样品有58.62%被近红外光谱检测识别为阳性，是造成结果假阳性的主要原因；无症状叶和缺素黄化叶阳性样品识别率较低，分别为36.01%和40.00%，即无症状叶阳性样品有63.99%、缺素黄化叶阳性样品有60.00%被近红外光谱检测识别为阴性，是造成结果假阴性的主要原因；均匀黄化叶和其他黄化叶总识别率较低，进而降低了整个模型的总识别率。

表1 柑桔黄龙病手持式近红外光谱仪模型对秋季不同叶片样品的识别率

2.3 不同时期样品验证情况

利用11月样品建成的模型去验证2月采集光谱样品，总识别率64.58%，阳性样品识别率61.22%，阴性样品识别率67.09%，假阳性率18.83%，假阴性率16.59%(见表2)。与11月样品建成模型自身相比，总识别率、阳性样品识别率、阴性样品识别率均降低，而假阳性率、假阴性率却上升；无症状叶假阴性率提高16.06个百分点，斑驳黄化叶假阴性率提高7.1个百分点，是致使阳性样品识别率降低的主要原因；其他黄化叶假阳性率提高14.38个百分点，是致使阴性样品识别率降低的主要原因。

表2 柑桔黄龙病手持式近红外光谱仪模型对春季不同叶片样品的识别率

3 讨论

本研究发现，11月经Nested-PCR检测为柑桔黄龙病阳性的无症状叶样品和缺素黄化叶样品，分别有63.99%和60.00%被近红

外光谱检测识别为阴性，分析原因是这部分无症状叶带菌量低，对叶片近红外光谱影响极小，接近正常叶近红外光谱；其他黄化叶、均匀黄化叶经Nested-PCR检测为阴性的样品，分别有58.62%、54.96%被近红外光谱检测识别为阳性，分析原因这部分叶片症状可能是烂根、树体损伤等原因所致，其黄化症状接近黄龙病菌引起的黄化，近红外光谱相似。因此，带菌的无症状叶会造成近红外光谱检测结果假阴性，而烂根、损伤导致的其他黄化叶和均匀黄化叶则会造成近红外光谱检测结果假阳性，是致使近红外光谱模型识别准确率降低的重要原因，这与王娟等[15]的研究结果相符。近红外光谱检测无损、快速，但在对无症状叶、缺素黄化叶、均匀黄化叶、其他黄化叶(烂根、树体损伤所致)检测中灵敏度有待提高。

11月样品建立的模型在用2月样品进行验证时，总识别率降低，其中阳性样品识别率下降较多，达22.19个百分点。分析原因是样品本身近红外光谱存在差异，沙田柚感染黄龙病后表现症状到11月时最明显，在2月时相对较轻，且2月是树体恢复生长时期，叶片相对秋冬季会返绿，水分增加，光泽度变高，与未感染黄龙病叶片症状差异减小，同时，不同时间采集近红外光谱时外界环境因素存在差异。因此，不同时期黄龙病叶片症状不同会导致近红外光谱差异，黄龙病叶片秋冬季症状表现最明显，与未感染黄龙病叶片特征差异最大，含水量偏低[16]，此时近红外光谱差异也最大，检测准确率较高。近红外光谱检测仪采集叶片光谱时要求较高，会受到外界测量条件光强、水分、灰尘等的干扰[16]，模型在检测使用时间、环境上有局限性。

在王娟等[15]开展的手持式近红外光谱仪识别沙糖桔黄龙病研究中，黄龙病检测综合符合率为78.6%，其中阳性符合率为73.6%，假阳性率为10.7%，阴性符合率为82.5%，假阴性率为10.0%。这与本研究建立的沙田柚标准数据库模型基本一致，识别率均不算高，离田间使用要求还存在差距。在今后黄龙病近红外光谱检测技术研究中，应尽量减少不同时间样品症状、环境对其光谱的影响，同时提高其对带菌的无症状叶、缺素黄化叶和不带菌的均匀黄化叶和其他黄化叶等的检测灵敏度，以进一步提高其识别率。