PDGF-BB 基因多态性与新疆地区不同民族人群骨关节炎易感相关性研究

王梦雨，王 超，朱洲均，石 冲，向 伟，王 堆，邱贞宇，史晨辉，王维山*

1.石河子大学第一附属医院 骨科中心，新疆 石河子 832000；2.石河子大学 医学院，新疆 石河子832000

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种受生物力学与生物化学共同影响的慢性退行性关节疾病，是成年人常见的肌肉骨骼疾病。据估计，到2040 年将有7 800万人患骨关节炎[1]，导致残疾和生活质量下降。关节疼痛是骨性关节炎的明确症状，但其病因尚不清楚[2]。OA 的发生与遗传、年龄、性别、体重、关节创伤和异常机械负荷等因素有关[3]。OA 病变主要包括关节软骨退变钙化、滑膜炎症、骨赘形成、软骨下囊肿、软骨下骨重塑、硬化、血管侵袭以及骨软骨界面渗透性增加[4-5]。OA 与民族、性别、体重、年龄、遗传、饮食、生活方式及生活环境等密切相关，不同国家、地区、民族其患病率及影响因素均不相同。软骨下骨血管生成增多，血管突破基底进入无血管软骨，是骨关节炎的诊断特征。Xu 等[6]研究证明来源于破骨细胞的PDGF-BB 是骨关节炎发展过程中病理软骨下骨血管生成的关键驱动因素。

本研究分析新疆地区人群原发性膝骨关节炎(primary knee osteoarthritis，PKOA)的PDGF-BB 基因型，旨在探讨新疆地区汉族、维吾尔族人群基因型频率分布，为其与原发性OA 等相关的研究提供依据，从基因角度探讨原发性OA 发病的遗传易感因素。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机选取2019 年1 月至2020 年11 月石河子大学第一附属医院、农三师医院、图木舒克市人民医院PKOA 汉族患者80 例，其中男性28 例，女性52例(年龄48～81 a，平均年龄56.66 a)，正常对照组186 例(年龄41～74 a，平均年龄55.61 a)，男性78例，女性108 例；维吾尔族PKOA 患者91 例，其中男性42 例，女性49 例(年龄41～72 a，平均年龄56.82 a)，正常对照组162 例，男性63 例，女性99例(年龄40～78 a，平均年龄54.30 a)。所选取的研究对象均为长期生活在新疆地区的人群。

1.2 主要仪器与试剂

PCR 热循环仪(Eppendorf Master-cycle gradient，Germany)，低温高速离心机(HerauesD-37520，Germany)，F-90 型多功能暗箱紫外透射仪，DNA 试剂提取盒(北京天根生化公司)，琼脂糖，rs1800817、rs2285094 Pcr 上下游引物。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

住院或在门诊取病人的外周血2 ml，存放于EDTA 管中；农三师和图木舒克的样本根据病人信息在当地医院检验科中收集。将所收集的样本放置于-80 ℃冰箱中储存。

1.3.2 DNA 的提取

采用全血DNA 基因提取盒，按照操作步骤提取DNA，将提取出的DNA 至于1.5 ml 冻存管中，并在紫外线分度仪下测出提取的DNA 浓度，将浓度合格的DNA 样本至于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.3 引物设计

使用上海生工生物有限公司的软件设计PDGFBB 的rs1800817 位点上游引物CGC TCT TCC TGT CTC TCT GC；下游引物GTT CTC GGG TTC CCA AAG GG。rs2285094 位点的上游引物CCA TGT GCT GAC CAC TTC AT；下游引物GCC ACA TAA CAG GTC TGG CT。

1.3.4 PCR 扩增

使用移液枪将解冻好的DNA 吸出3 μl、rs2285094 位点上及下游引物各1 μl、PCR mix10μl、无酶水5 μl 至离心管中组成共20 μl 的反应体系(见表1)；将PCR 管放入96 孔的梯度PCR 仪里之后再设定PCR 扩增反应条件：①预变性94 ℃5 min②变性94 ℃30 min ③退火62 ℃30 min ④延伸72 ℃27 min ⑤重复延伸72 ℃5 min ⑥取出反应体系标记并放入-20 ℃冰箱中备用。用相同的方法进行rs1800817 位点DNA 扩增。

表1 PCR 反应体系

1.3.5 凝胶电泳及成像

用微量加样枪吸出6 μl DNA maker 加入凝胶的第一个孔中，再取4 μl DNA 与DNA 上样缓冲液(loading buffer1 μl)的混合液加入其他凝胶孔内并做好记录。将完成加样的凝胶平放在水平电泳仪的电泳板上，向电泳板内加入TBE 溶液进行电泳。电泳参数：电压100～120 V；电泳时间：35 min。在电泳结束后，将电泳凝胶取出放在成像仪内，通过调整凝胶块位置合适后进行曝光，将曝光后的图像保存并记录。

1.3.6 DNA 测序

将经过凝胶电泳过并通过凝胶成像系统确认PCR 成功后的DNA 样本标号记录，送至博迈德(北京)基因技术有限责任公司进行DNA 双向测序。

1.4 统计分析

本研究利用SPSS 22.0 软件进行统计分析。对样本人群的年龄、身高、体重等计量资料进行正态性检验，符合正态分布的资料采用¯x±s 进行统计描述，对分类资料如性别、是否吸烟、是否饮酒等采用n(%)表示；采用哈迪-温伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium)方法对基因位点的基因型分布进行检验；对两组间计量资料的比较采用t 检验，对计数资料的比较采用卡方检验；应用 二分类logistic回归模型对患PKOA 的相关风险因素进行分析。其中以P＜0.05 作为差异具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 研究对象的基线资料比较

分别对新疆地区的汉族与维吾尔族膝骨性关节炎组与非膝骨性关节炎组的年龄、身高、体重、BMI、性别、是否抽烟、是否喝酒(见表2)进行比较，各组间无统计学差异(P＞0.05)。性别、是否吸烟、是否饮酒、是否从事重体力劳动进行比较，各组间无统计学差异(P＞0.05)。见表2。

表2 一般资料

2.2 PCR 和基因测序结果

将所提取的汉族PKOA 组和对照组、维吾尔族PKOA 组和对照组的DNA 分别加入PDGF-BB 的rs1800817 位点引物、rs2285094 位点的引物在PCR仪中扩增，将扩增后的DNA 行2%琼脂糖凝胶电泳。将扩增结果满意的DNA 送至北京博迈德基因公司进行双向测序，分析受试者的 PDGF-BB 的rs1800817 位点、rs2285094 位点基因型。比较SNP中的rs1800817 位点与实验中的rs1800817 位点，有GT、GG 两种基因型；比较SNP 中的rs2285094 位点与实验中的rs2285094 位点，有CT、CC 两种基因型。

2.3 PDGF-BB 的rs1800817 位点、rs2285094 位点基因多态性与维吾尔族PKOA 的相关性

维吾尔族PKOA 组PDGF-BB 的rs2285094 位点的CC型、CT型分布不同(χ2=17.9，P＜0.001)，有统计学差异，PKOA 组PDGF-BB 的rs1800817 位点的GT 型、GG 型分布不同(χ2=5.08，P＜0.05)，无统计学差异。见表3。说明维吾尔族携带rs2285094和rs1800817 位点的CC 型、CT 型的个体患原发性PKOA 有相关性。

表3 维吾尔族PKOA 与对照组的基因型分布

2.4 PDGF-BB 的rs1800817 位点、rs2285094 位点基因多态性与汉族PKOA 的相关性

汉族PKOA 组PDGF-BB 的rs2285094 位点的CC型、CT 型分布(χ2=0.001，P=0.98)与非PKOA 组无统计学差异，PKOA 组PDGF-BB 的rs1800817 位点的GT型、GG 型分布(χ2=4.61，P=0.032)与非PKOA 组有统计学差异。见表4。说明汉族携带rs1800817 位点的CC 型、CT 型的个体患PKOA 有相关性；而与携带rs2285094 无相关性。

表4 汉族PKOA 与对照组的基因型分布

2.5 影响OA 患病率的多因素Logistic 回归分析

经多因素Logistic 回归分析，年龄、民族、rs1800817位点、rs2285094 位点基因多态性是OA 的危险因素；其中民族是PKOA 的危险因素，这可能与不同民族间的生活方式及饮食不同有关，性别、BMI、抽烟、饮酒、从事重体力劳动不是OA 的危险因素。见表5。

表5 影响OA 患病率的多因素Logistic 回归分析

3 讨论

OA 是全球最常见的关节疾病，60 a 以上的男性约有10%，女性约有18%[5-6]。较大的体重、反复外伤或手术联合结构、出生时关节异常、痛风、糖尿病以及与荷尔蒙相关的疾病等，已经被证明为OA[7-8]的风险增加，其特征是进行性退化的关节软骨，软骨下骨的结构改变，骨赘形成和滑膜炎症[9-11]。此外，血管生成在组织修复和骨性关节炎的病理生理中起着重要作用[12]。但目前治疗骨关节炎尚未有有效的疾病调节剂，Walsh 和Mapp 等研究表明骨关节炎关节内的血管生成，即从已有的血管中生成新血管，是已知的促进OA 进展的因素[13-14]。特别是软骨下异常的骨血管生成导致血管系统入侵骨软骨连接是人类骨关节炎的一个标志[15]。有研究表明PDGF-BB 的基因多样性与金属裸支架术后再狭窄有一定的关系[16]。Arora-Singh和Gourh 在研究中发现PDGF-BB 中的rs2285094位点基因多样性与硬皮病的发生有一定的相关性。[17-18]近年来Su 等[19]在实验研究中发现PDGFBB 异常增加，诱导软骨下骨血管生成，促进骨关节炎的发展。

综上所述，PDGF-BB 与骨关节炎的发生发展有着密切的关系。PDGF-BB 基因多样性与许多疾病都有着密切关系，但PDGF-BB 基因多样性与骨关节炎的关系以往无相关的研究。本实验通过病例对照研究，使用卡方检验、多因素logistic 回归等方法，分析了PDGFBB的rs1800817位点、rs2285094位点多样性与新疆地区汉族和维吾尔族膝骨性关节炎发病风险的关联。研究结果表示，rs1800817 位点基因型分布在汉族和维吾尔族中均有差异(χ2=5.08，P=0.024；χ2=4.61，P=0.032)；rs228509 位点基因型分布在汉族中无差异(χ2=0.01，P=0.98)；rs2285094 位点基因型分布在维吾尔族中有明显差异(χ2=17.79，P=0.00)。通过多因素logistic 回归分析，年龄是骨性关节炎的危险因素(OR=1.007)，民族是骨性关节炎的保护因素，这可能是维吾尔族与汉族的生活习惯不同所造成的，这与沈明球等人的流行病学研究所一致[20]。rs2285094 位点中的CC型和CT 型是骨性关节炎的保护因素(OR=0.011)，这提示rs2285094 位点中的CC 型和CT 型携带者可能会减低发病风险，但该位点的基因型分布在汉族人群中的分布无差异(χ2=0.01，P=0.98)；rs1800817 位点中的GT 型和GG 型是骨性关节炎的危险因素，这提示rs1800817 位点中的GT 型和GG 型携带者可能会增加发病风险。这可能与本研究样本量较小有关，限制了相关性的统计功效，存在一定局限性。此外，PDGF-BB基因多态性对膝关节骨性关节炎易感性可能为原发性膝骨性关节炎的预防和治疗提供依据，因此有关结论尚需进一步验证。