基于网络药理学分析复方鬼针草颗粒治疗高血压的作用机制*

彭广操，乔利杰，李彬，王建茹，孙阳，朱明军

1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州450000；2.河南中医药大学，河南 郑州450046

高血压是一种以动脉血压持续升高为表现的进行性“心血管综合征”［1］，常导致脑卒中、冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）、心力衰竭、左心室肥厚、心房颤动、终末期肾病等临床疾患的发生［2］。为减少心血管风险及防止其他并发症的出现，提高高血压患者的寿命及生活质量，临床早期干预非常重要。随着青年高血压患病率的升高，预防关口更应前移［2］。

高血压属中医“眩晕”“头痛”范畴。病位在清窍，涉及肝、脾、肾三脏，风、火、痰、瘀、虚是重要的致病因素。该病多因工作压力大、饮食不节、久坐不动、肥胖、熬夜等导致痰湿阻遏，升降失常，痰火气逆，上犯清窍，瘀血停着，痹阻清窍而发病。据此理论并结合多年临床经验，创制了具有“祛湿化痰、清热泻火、活血化瘀”功效的复方鬼针草颗粒。该药由鬼针草30 g，茵陈30 g，夏枯草20 g，丹参15 g，玉米须30 g，大黄5 g组成。现代研究发现，鬼针草能够抑制肾素和血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性［3］、增加NO的产生，减少内源性缩血管活性物质血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）和内皮素－1（endothelin－1，ET－1）的释放［4］，从而降低血压、逆转左心室肥厚、改善心功能［5］。茵陈通过降低ACE活性，减少AngⅡ的产生，增强血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达和抑制RAS同源基因家族成员A（RhoA）表达实现降低血压［6］。夏枯草有抑制去甲肾上腺素引起的家兔胸主动脉收缩的作用［7－8］，降低肾上腺素模拟病态下的家兔血压［9］。丹参通过提高NO构成酶的水平，扩张血管而降低血压［10－11］。玉米须降低AngⅡ水平，并具有抗氧化应激作用，对自发性高血压大鼠有降压作用［12］。大黄能抑制去氧肾上腺素和组胺诱导的缩血管反应［13］。以上研究提示，6种中药均具有一定的降压作用，在临床上对高血压1级患者也显示了较好的治疗效果。然而复方鬼针草颗粒治疗高血压的药理学机制尚不明确，故本研究拟应用网络药理学方法研究复方鬼针草颗粒治疗高血压的药效物质基础及分子机制，为其后续研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 活性成分的获取及筛选利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）数 据 库（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）进行检索，获得鬼针草、茵陈、夏枯草、丹参、玉米须、大黄的化学成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug－likeness，DL）≥0.18为条件［14］，筛选出复方鬼针草颗粒的有效活性成分。

1.2 药物靶点及疾病靶点的获取利用PubChem数据库（http：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）获取活性成分的Smiles结构，利用活性成分的Smiles结构在Swiss Target Prediction数据库中（http：／／www.swisstargetprediction.cn／）对药物作用靶点进行预测，并以Probability≥50%为条件进行靶点筛选。将在Swiss Target Prediction数据库与TCMSP数据库中获得的药物靶点进行整合得到所有的药物作用靶点。通过Uniprot数据库（http：／／www.uniprot.org／）对靶点进行标准化。在GeneCards数据库（https：／／www.genecards.org／）与OMIM数据库（http：／／www.omim.org／）中以“hypertension”为关键词对疾病靶点进行预测，由于高血压靶点过多，设置Relevance score≥5%为条件对靶点进行筛选。

1.3 共同靶点筛选及蛋白相互作用（protein－protein interaction，PPI）网络构建将药物作用靶点与疾病靶点导入Veney2.1软件（http：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）中取交集，获取药物－疾病共同靶点，并绘制韦恩图。在STRING数据库（https：／／string－db.org／）中检索药物－疾病共同靶蛋白，物种设置为“Homo sapiens”，设置相互作用阈值≥0.400，并隐藏游离点，得出共同作用靶点之间的互作关系，将其导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。

1.4 “中药－活性成分－靶点－疾病”网络的构建

将药物－疾病的共同靶点导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建出“中药－活性成分－靶点－疾病”相互作用网络图。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）分析和KEGG通路富集分析将上述共同作用靶点导入DAVID数据 库（https：／／david.ncifcrf.gov／）进 行GO和KEGG通路注释，以P值＜0.05为条件筛选出相应的通路。在Omishare Tool（https：／／www.omicshare.com／tools／Home／Soft／seniorbubble）的高级气泡图中将其结果可视化。

2 结果

2.1 活性成分的获取及筛选结果利用TCMSP数据库收集复方鬼针草颗粒中各味中药所含的化合物成分，然后根据OB、DL值筛选后得到鬼针草、茵陈、夏枯草、丹参、玉米须、大黄所含活性成分依次为6、13、11、65、12、16个，去除8个重复活性成分及21个未找到对应靶点的活性成分，共获得有效活性成分94个。其中木犀草素（luteolin）为鬼针草、夏枯草、丹参、玉米须4种药物的共同活性成分，槲皮素（quercetin）为鬼针草、茵陈、夏枯草3种药物的共同活性成分，β－谷甾醇（beta－sitosterol）为茵陈、夏枯草、大黄3种药物的共同活性成分，豆甾醇（stigmasterol）为夏枯草、玉米须两种药物的共同活性成分。见图1。

2.2 疾病靶点的收集、药物作用靶点的预测及网络的构建将94个复方鬼针草颗粒活性成分导入Swiss Target Prediction数据库，将所得靶点与TCMSP数据库中所得靶点合并获得复方鬼针草颗粒所有靶点。检索GeneCards数据库与OMIM数据库筛选出与高血压相关疾病靶点。将复方鬼针草颗粒所有靶点与疾病靶点导入Veney2.1软件，最终获得药物－疾病共同作用靶点146个，并绘制韦恩图。见图2。

2.3 蛋白相互作用网络的构建和分析将146个共同靶点导入STRING数据库中，得到蛋白与蛋白之间的相互作用关系，然后通过Cytoscape3.7.2软件进行可视化，见图3。由图可知复方鬼针草颗粒共同靶点的PPI网络图中有145个节点，20 880条边，平均节点度值（Degree）为38.152。颜色越深、节点越大的圆形靶标节点表示Degree越高，说明其在复方鬼针草颗粒治疗高血压靶标网络中的作用越重要。

图1 复方鬼针草颗粒所含活性成分的Upset图

图2 复方鬼针草颗粒－高血压靶点韦恩图

图3 复方鬼针草颗粒治疗高血压靶点蛋白的PPI网络图

2.4 “中药－活性成分－靶点－疾病”网络构建

利用Cytoscape3.7.2软件将6种药物、94个药物活性成分与146个疾病靶点相连，绘制出“中药－活性成分－靶点－疾病”相互作用网络图，见图4。其中药物与疾病用圆形表示，活性成分用三角形表示，靶点用箭头表示，此网络共包括247个节点、1 580条边。结果显示，槲皮素（度值104）、山柰酚（度值48）、木犀草素（度值45）等活性成分度值较高。核心靶点涉及血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、RAC－α丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（RAC－alpha serine／threonine－protein kinase，AKT1）、白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

图4 复方鬼针草颗粒的“中药－成分－靶点－疾病”网络图

2.5 GO富集分析对146个共同靶点进行GO富集分析，GO富集分析包括生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）及细胞组分（cellular component）3个分支。设定阈值P＜0.05，共富集854个条目。结果显示，复方鬼针草颗粒治疗高血压的生物过程涉及药物反应、缺氧应答、衰老、血管收缩正调控、细胞对脂多糖的应答、细胞增殖正调控、基因表达正调控、凋亡过程负调控、对雌二醇应答等，与酶结合、蛋白结合、血红素结合、类固醇激素受体活性、细胞活性因子、蛋白同源二聚化活性、肾上腺素结合、类固醇结合、蛋白异源二聚化活性等分子功能相关，涉及细胞外间隙、浆膜、陷窝、膜筏、质膜整体成分、细胞外区、细胞表面、质膜外侧、受体复合物、顶端质膜等细胞组分。筛选每个组分靠前的前10个条目，绘制图表，见图5。

2.6 KEGG通路富集分析KEGG通路富集，设定阈值P＜0.05，共富集到122条通路，选择密切相关的前20条信号通路，通过Omicshare软件制作高级气泡图，见图6。复方鬼针草颗粒治疗高血压主要涉及蛋白多糖、TNF信号通路、乙型肝炎、膀胱癌、南美锥虫病（美洲锥虫病）、低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor－1，HIF－1）信号通路、疟疾、利什曼病、胰腺癌、叉头状转录因子（forkhead transcription factor，FoxO）信号通路、黏着斑、弓形虫病、环磷酸鸟苷（3′－5′－cyclic guanosine monophosphate，cGMP）－蛋白激酶G（dependent protein kinase G，PKG）信号通路、磷酸肌醇3激酶（phosphoinositol 3 kinase，PI3K）－苏氨酸蛋白激酶（threonine－protein kinases，AKT）信号通路、催乳激素信号通路、类风湿性节炎、Toll样受体（Toll－like receptors，TLRs）信号通路、百日咳、结直肠癌等。

图5 复方鬼针草颗粒治疗高血压潜在靶点的GO富集分析条形图

3 讨论

高血压的发病主要与肾素－血管紧张素－醛固酮系统激活、血管内皮功能受损、交感神经系统兴奋、胰岛素抵抗、炎症反应等有关［15－17］。此外，血管收缩、细胞增殖、凋亡调控等生物过程，已被证实在高血压的发病过程中起着重要作用［18－19］。

本研究应用网络药理学方法，对复方鬼针草颗粒治疗高血压的药效物质基础及作用机制进行了预测分析。结果显示：复方鬼针草颗粒治疗高血压的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚和木犀草素等94个，核心靶点涉及VEGFA、AKT1、IL－6、TNF等146个。现代药理研究显示，槲皮素具有降低血压、抗氧化、抗炎、调节免疫功能等作用［20－22］，可以通过调节肠道菌群，减少脂多糖的产生，下调TLR4／核因子κB（nuclear factor－κB，NF－κB）p65的表达，进而降低血压［23］；山柰酚可能通过抗炎、对蛋白激酶抑制、免疫抑制、抗动脉粥样硬化及降糖等作用调节血压［24］；木犀草素通过抑制氧化应激和NF－κB的激活而降低血压［25］。有关核心靶点参与高血压病理过程的相关文献研究显示，VEGFA能够促进血管生成，维持血管内皮功能完整［26－27］，与血压升高呈正相关。AKT1在细胞增殖、迁移、调控凋亡等方面发挥重要作用，抑制AKT后可加强由NO引起的血管舒张而发挥降压作用［28］，并能在活化后促进AngeⅡ诱导的高血压心肌纤维化［29］。TNF引起血管内皮损伤，导致血管重塑［30］，还能促进IL－6的表达，参与血管平滑肌细胞的增殖、分化和调控，使管壁增厚、管腔狭窄、外周血管阻力增高，最终导致高血压发生［31］。IL－6与原发性高血压具有独特相关性，它可引起血管收缩、与血管紧张素Ⅱ相互作用等多种途径引起血压升高［32］。从以上结果可以看出，这些核心靶点与血管内皮功能密切相关，这也是对GO富集分析结果中核心靶点调控血管收缩、细胞增殖、凋亡等生物过程的佐证。

KEGG通路富集分析的结果显示，复方鬼针草颗粒治疗高血压涉及的通路主要包括TNF信号通路、HIF－1信号通路、cGMP－PKG信号通路、PI3K－Akt信号通路、TLRs信号通路等。研究显示，HIF－1、cGMP－PKG、PI3K－Akt等信号通路与血管内皮功能密切相关，参与了高血压的发生发展。HIF－1信号通过对NO的调节影响血管舒张，进而调控血压水平［33］。cGMP－PKG信号通路可由NO激活，导致血管平滑肌松弛，扩张血管，降低外周血管阻力，从而降低血压［34］。PI3K／Akt信号通路通过磷酸化L－型钙通道上的Cavβ2α亚基激活L－型钙通道引起Ca2＋内流，从而导致血管收缩［35］，因此，抑制PI3K／Akt信号通路可以降低血压。TNF、TLRs等信号通路与炎症相关，介导了高血压的发病。TNF信号通路被激活产生炎性复合物，通过激活NF－κB抑制酶以及丝裂原活化蛋白激酶，调节炎症反应，促进高血压的发生发展［36］。TLRs中的TLR4与配体结合后，激活下游的NF－κB信号通路，产生促炎因子［37］，是导致高血压发病的机制之一。这些研究结果也进一步支持了本研究结果的科学性和可靠性。

综上所述，本研究所预测的复方鬼针草颗粒的活性成分所作用的作用靶点，不同程度地参与了上述生物学过程和信号通路而发挥降低血压作用，为后续进一步进行该药治疗高血压的基础研究及临床应用提供了参考依据。