三叶青总黄酮影响心肌细胞的活性及DJ-1表达

郭永梅

（江西医学高等专科学校药学院，江西 上饶 334000）

心肌缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤模型是一种缺血性心肌病及心脏手术后出现心衰的常见损伤模型[1]。近年来，研究表明，许多中药的活性成分可以适当地减少心肌H/R损伤[2]。三叶青是我国家特有的药用植物，具有清热解毒祛肿等功效[3]。迄今为止，关于三叶青总黄酮对心肌H/R损伤的保护作用鲜见报道。本研究三叶青总黄酮对H9C2细胞H/R损伤的保护作用。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

H9C2细胞（中科院上海细胞库）。

1.2 药物与试剂

三叶青（怀玉山）；高糖DMEM培养基（碧云天）；胎牛血清（四季青）。

1.3 主要仪器

SW-CJ-1F超净工作台（安泰技术有限公司）；荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）；IX71倒置荧光显微镜（奥林巴斯）。

2 方法

2.1 细胞的培养

细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中于37℃，5%CO2下培养，当细胞融合度达85%左右时传代，每3天传代1次，取对数生长期细胞接种，以便进行后续实验。

2.2 三叶青总黄酮对H9C2细胞的活性实验

将高糖的DMEM（含10%胎牛血清）来培养大鼠源永生化H9C2细胞，制成5×104mL的细胞悬液，按100μL/孔接种在96孔板，于37℃二氧化碳培养箱（含5% CO2）中孵育24 h，吸弃原培养液，分别用3、6、9、18、36、72μg·mL-1等浓度的三叶青总黄酮处理24 h。结束前4 h加入1.9 mg·mL-1的MTT液20μL，再继续培养4 h，用到酶标仪于490 nm波长进行检测光的密度D（λ）值。

2.3 H9C2细胞H/R模型的建立

按2.2项处理，用DMEM培养液配制氯化钴的溶液，浓度在600～1 600μmol·L-1之间，分别于6 h、12 h、18 h、24 h确定氯化钴的浓度及缺氧的时间。估约最佳的复氧时间，缺氧的时间完成后，摒弃那些缺氧的液体，用高糖的DMEM培养液（含10%胎牛血清）分别进行复氧1 h、2 h、3 h、6 h。

2.4 药物处理

实验为正常的组，H/R的模型的组和三叶青总黄酮低的（3μg·mL-1）、中的（6μg·mL-1）、高的（9μg·mL-1）浓度预处理的组。

2.5 指标检测

按试剂盒检测SOD、LDH、MTT及Westen blot测定DJ-1蛋白表达。

2.6 统计学处理

用SPSS17.0分析，计量用mean±sd表示，方差分析比较组与组之间的差别。

3 结果

3.1 三叶青总黄酮对H9C2细胞成活率的影响

结果如图1所示，当药物的浓度达到了9μg·mL-1时，H9C2细胞的成活率显著高于空白对照组，但是随着药物的浓度的逐渐提高，H9C2细胞的成活率则逐渐地降低，故而以三叶青总黄酮9μg·mL-1为最高地浓度，依次设定低、中、高浓度分别为3、6、9μg·mL-1。

图1 三叶青总叶黄酮对H9C2细胞成活率的影响

3.2 H9C2细胞H/R模型的建立

当氯化钴地浓度为1 200μmol·L-1，缺氧地时间为18 h，复氧地时间就为2 h是本实验细胞H/R损伤模型的最佳地条件。

3.3 三叶青总黄酮对H/R损伤大鼠源永生化H9C2心肌细胞成活率的影响

结果如图2所显示，与模型地组相对比，三叶青总黄酮6、9μg·mL-1组细胞成活率显著升高（P＜0.05）。

3.4 三叶青总黄酮对H/R损伤H9C2细胞上清液中LDH及细胞内SOD水平的影响

比较正常对照地组，模型地组的上清液中的LDH及细胞内MDA水平明显提高，细胞内SOD活性明显下降（P＜0.05）。

3.5 三叶青总黄酮对H/R损伤H9C2心肌细胞DJ-1蛋白表达的影响

结果如图3所示，比较正常对照的组，模型的组的DJ-1蛋白表达明显升高（P＜0.01）。比较模型的组，三叶青总黄酮中剂量的组、高剂量的组DJ-1蛋白表达明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。

图2 不同复氧时间对H9C2细胞成活率的影响

图3 三叶青总黄酮对H/R损伤H9C2心肌细胞DJ-1蛋白表达的影响（*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较）

4 结语

实验的结果显示，经三叶青总黄酮的处理后，细胞内的MDA含量下降，而SOD的活性增加，由此可以看出，三叶青总黄酮能降低细胞的H/R的损伤。