基于气相色谱法测定食品中甜蜜素的碱性水解法研究

刘志鹏，杨李胜，王小鹏，黄敏兴，林继钦，余构彬，陈其钊*

（1.广东省科学院生物工程研究所，广东 广州 510316；2.中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心，广东 广州 510316）

甜蜜素（sodium cyclamate），其化学名称为环己基氨基磺酸钠（C6H11NHSO3—Na），由氨基磺酸与环己胺及NaOH反应而制成的非营养型合成甜味剂，是食品生产中常用的添加剂，其口感好、价格低廉，甜度为蔗糖的30倍～40倍[1-2]。关于甜蜜素的安全性，学术界仍无定论。我国科学家在研究甜蜜素安全性方面有一定的成果，叶桂珍[3]采用体重为24g～29g的NIH小鼠进行对照实验，结果发现，受试小鼠未出现癌变。黄俊明[4]采用NIH小鼠进行急性毒性实验、蓄积毒性实验和小鼠骨髓微核实验后得出结论，甜蜜素属于无毒化合物，且无致畸致突变性。但如果经常食用甜蜜素含量超标的饮料或其它食品，就会因摄入过量，对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显[5]。因此，我国食品安全国家标准GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定了甜蜜素使用范围[6]。由于食品的组成成分比较复杂，所以食品中甜蜜素有不同的前处理和检测方法。目前国内外食品中甜蜜素检测的方法主要有：气相色谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-11]、离子色谱法[12-13]、气相色谱串联质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[14-15]、液相色谱串联质谱法[16-18]、比色法[19]等方法。比色法检出限高，不利于低浓度的检测。气相色谱质谱法和液相色谱质谱法由于仪器昂贵，仪器使用成本高，不利于方法的推广。离子色谱法对基质洁净度要求高，前处理过程繁琐。目前甜蜜素含量检测采用最多的是GB5009.97—2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中的第一法，即气相色谱法[20]。但该方法在检测时经常会同时出现两个峰，分别是主峰环己醇亚硝酸酯和次峰环己醇。日常的检测发现随着处理时间的延长和温度的上升，主峰环己醇亚硝酸酯逐渐减小，而次峰环己醇逐渐增大，对定量造成影响。推测其可能的原因是，酯类物质在酸性和高温条件下发生可逆反应生成醇和酸。程水连等[21]曾研究过在前处理过程中加入氢氧化钠，在碱性水解条件下促使环己醇亚硝酸酯向环己醇的方向转变。本次研究主要在国标法的基础上改进，采用进一步碱性水解，使环己醇亚硝酸酯完全转化为环己醇，通过气相色谱外标法测定样品酯化后的水解产物环己醇的含量，从而间接准确测定甜蜜素的含量。再通过对水解液的pH值、反应温度对整个反应体系影响的研究，进一步优化方法，为检测食品中的甜蜜素提供更多选择。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验所用的样品：市售。

正庚烷（色谱纯）：美国默克公司；环己基氨基磺酸钠标准品（质量分数为99.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；氯化钠、亚硝酸钠、浓硫酸、氢氧化钠（分析纯）：广州化学试剂厂；试验用水均为一级水。

气相色谱仪（7890A）：美国安捷伦公司；电子天平（TLE204E）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；涡旋振荡器（VB424）：德国Wiggens公司；台式高速冷冻离心机（H1850R）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 环己基氨基磺酸钠标准使用液的制备

精确称取0.561 2 g环己基氨基磺酸钠标准品，加入水溶解并定容至100 mL，混匀，备用。此溶液1.00 mL相当于环己基氨基磺酸5.00 mg（环己基氨基磺酸钠与环己基氨基磺酸的换算系数为0.890 9）。准确移取20 mL，用水稀释定容100 mL（浓度为1.00 mg/mL）。

1.2.2 其它溶液配制

40 g/L氢氧化钠溶液的制备：称取4 g氢氧化钠，加水溶解，后用水定容至100 mL，混匀，静置备用。

200 g/L硫酸溶液的制备：量取54 mL浓硫酸，缓慢加入400 mL水中，后加水定容至500 mL，混匀，静置备用。

50 g/L亚硝酸钠溶液的制备：称取5.00 g亚硝酸钠，加水溶解，后用水定容至100 mL，混匀，静置备用。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；柱流速：1.5 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；分流比：10 比 1；检测器（flame ionization detector，FID）温度：300 ℃；氢气（H2）流速：30 mL/min；空气流速：400 mL/min；程序升温：起始温度70℃，停留5 min后以60℃/min升温至320℃。

1.2.4 样品前处理

称取样品3.00 g于50 mL容量瓶中，加30 mL水振摇，超声20 min后定容。从容量瓶中吸取10 mL溶液于50 mL离心管中冰浴5 min后，加入正庚烷5.00 mL，亚硝酸钠溶液，硫酸溶液各2.5 mL。摇匀，在冰浴中放置30 min，并经常摇动，取出置于50℃热水浴中加入氢氧化钠溶液，调至pH 10，30 min后将试液冷却至25℃，加入2.5 g氯化钠，摇匀后置涡旋混合器上振动1 min（或振摇80次），待静置分层后取上层清液进行气相色谱分析。

1.2.5 水解条件的优化

环己醇亚硝酸酯能否顺利转化环己醇在于水解过程，此过程主要由两个因素影响，分别是pH值和水解温度。水解 pH 值选择：8、9、10、11、12、13；水解温度选择：30、40、50、60、70、80 ℃。优化试验前处理按照1.2.4，固定其它条件，以某一水解条件为变量，通过测定目标物回收率，比较不同水解条件对结果的影响，从而选择最佳试验条件。

2 结果与分析

2.1 水解条件的优化

2.1.1 水解pH值的选择

不同pH值下测出的甜蜜素回收率见图1。

图1 甜蜜素回收率随水解pH值的变化Fig.1 Change of sodium cyclamate recovery rates in different hydrolytic pH

由图1可以看出，甜蜜素回收率先随pH值的增加而增加，在pH值为10处达到最大，后随pH值增加而降低。即在pH值为10的条件下，甜蜜素的回收率最高，因此确定用于水解的最适pH值为10。

2.1.2 水解温度的选择

不同温度下甜蜜素回收率见图2。

图2 甜蜜素回收率随水解温度的变化Fig.2 Change of sodium cyclamate recovery rates in different hydrolytic temperatures

由图2可以看出，甜蜜素回收率先随温度的增加而增加，在温度为50℃处达到最大，后随温度的增加而降低。即在温度为50℃的条件下，甜蜜素的回收率最高，因此确定用于水解的最适温度为50℃。

2.2 水解法标准曲线的配制

准确移取1.00 mg/mL环己基氨基磺酸标准溶液0.50、1.00、2.50、5.00、10.0、25.0 mL 于 50 mL 容量瓶中，加水定容后续步骤同1.2.3，配成标准溶液系列浓度：0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL。标准曲线见图3，得到的线性方程为：y=174.43x-0.040 93，相关系数R2=0.999 6。

图3 水解法标准曲线Fig.3 The standard curve in hydrolytic method

2.3 国标法与水解法的准确度与精密度比较

根据国标法和本试验方法的操作步骤，分别对市场上销售的4种样品进行处理，并进行准确度和精密度的比较分析见表1。

表1 两种方法测定结果的准确度与精密度比较（n=10）Table 1 The accuracy and precision of two methods in the study

从表1可以看出，国标法对4种不同样品的回收率在87.0%～98.6%之间，相对标准偏差在3.26%～5.22%之间，而水解法对4种不同样品的回收率在94.0%～104.0%之间，相对标准偏差在3.02%～4.75%之间。由此可以得出，水解法的准确度和精密度均比国标法好。

2.4 水解法的检出限与定量限

以目标峰高等于3倍基线噪音为检出限，等于10倍基线噪音为定量限。试验结果证明，在称样量为3.00 g，添加量为24 μg时，信噪比等于3，添加量为81 μg时信噪比等于10。因此，水解法的检出限与定量限分别为 0.008、0.027 g/kg，均优于国标法。

3 结论

本试验在国标方法的基础上增加水解步骤，通过测定水解后环己醇含量，间接准确测定甜蜜素含量。结果表明，样品经水解后用气相色谱法测定食品中甜蜜素含量的最适试验条件为：水解pH 10，水解温度50℃。该方法前处理简单、易操作、快速、可靠，为甜蜜素的测定方法提供更多选择。