黑羽番鸭AMH 基因多态性与产蛋及体重性状的关联分析

葛丽岩，胡志刚，张慧林，陈 强，刘小林*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省潼关安大番鸭育种场，陕西潼关 714300）

近年来，禽类行业发展迅速，肉蛋产品的消费比例逐渐提高[1]。黑羽番鸭的肉蛋产品营养价值高，受到广大消费者认可[2]。黑羽番鸭原产于南美洲热带地区，在中国经过多年驯化和人工选择，已成为我国优良肉用品种。雄性黑羽番鸭成年体重达3.5～4.5 kg，雌性黑羽番鸭成年体重为2.0～2.7 kg，适合集约化饲养。产肉量和产蛋量决定了黑羽番鸭的经济价值[3]。目前影响产蛋性能的相关研究大多集中在营养水平、疾病控制以及生长环境[4-6]等方面，少有从遗传育种角度研究基因多态性对产蛋性能的影响。

在育种工作中，为挖掘有效的遗传标记常对某基因的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）位点与生产性状之间进行关联分析。例如：周璇等[7]发现番鸭神经肽酪氨酸基因（NPY）的AG 基因型产蛋性能显著高于GG 基因型和AA 基因型；张杉杉[8]发现褪黑素受体1B 基因（MTNR1B）多态性位点（g.9880654 C＞T）和神经元特异基因家族成员1 基因（NSG1）多态性位点（g.63058214 C＞T）均与番鸭300 日龄产蛋量显著相关；牟芳[9]在海兰褐蛋鸡中发现α1B-肾上腺素受体基因（ADRA1B）和过氧化物酶体增值物激活受体γ辅激活因子1-β基因（PPARGC1B）多态性位点可作为产蛋性状的潜在分子标记。

抗缪勒氏管激素（Anti-Mullerian Hormone，AMH）在哺乳动物繁殖方向研究较多，但在家禽繁殖方向研究甚少。AMH 是TGFβ（Transforming growth factor beta superfamily，TGFβ）超家族配体成员[10]，是由雄性睾丸支持细胞和雌性卵巢颗粒细胞分泌的一种糖蛋白[11]。AMH基因位于20 号染色体，全长4 621 bp，包括4 个CDS 区，mRNA 长3 478 bp，AMH 蛋白包括670 个氨基酸，在性别分化以及卵泡发育中扮演重要角色。Emily 等[12]发现AMH基因在不孕妇女中存在与子宫内膜异位症相关的SNP 位点。在人AMH基因启动子区存在多态性位点，该位点的产生导致AMH 蛋白49 位异亮氨酸取代丝氨酸，影响AMH 的生物活性[13]。王莉娜[14]在猪AMH基因外显子区发现了插入的突变位点，携带插入位点的母猪产仔数显著高于未携带插入位点的母猪。吕爱霞等[15]在多囊卵巢综合症患者中发现AMH基因146 bp 处存在G/T 突变，该突变位点与辅助生殖技术以及辅助生殖技术激素水平有着重要关系。AMH通过AMHR2（Anti-Mullerian hormone receptor type 2，AMHR2）抑制卵泡对促卵泡激素（FSH）的敏感性，抑制卵泡的生长发育[16-18]。禽类排卵依赖于成熟卵泡的数量，卵泡选择过程的正常进行决定了禽类正常排卵[19]。本研究旨在通过对AMH基因SNP 位点与黑羽番鸭产蛋及体重的关联分析，筛选可靠的遗传标记，为黑羽番鸭育种工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与性状测定 本实验黑羽番鸭来自陕西安大农业发展有限公司潼关育种场，选用同一批次相同条件下饲养的笼养黑羽番鸭。记录黑羽番鸭的产蛋情况，统计300 日龄产蛋数（EN300）、280 日龄体重（280W）。随机选出186 只笼养黑羽番鸭，翅下静脉采血。

1.2 DNA 提取和引物设计 采用传统酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，根据NCBI 中的鸭AMH基因的DNA序列（NC_040065）设计PCR 引物，扩增AMH基因序列，引物由北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成（表1）。

表1 AMH 基因引物信息

1.3 PCR 扩增及产物检测 构建186 只个体DNA 混池，用引物AMH1～5 进行PCR 扩增，PCR 反应总体系20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，DNA 模板（500 ng/μL）2 μL，双蒸水6 μL；反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，Tm 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环，72℃ 5 min。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京擎科生物科技有限公司测序。

1.4 基因分型 选取适宜的限制性内切酶（表2），判定个体的基因型。酶切总体系10 μL：6 μL PCR 产物、1 μL(10×buffer)、0.2 μL（lounits/uL）限制性内切酶、2.8 μL ddH2O。过夜消化，用3%琼脂糖凝胶电泳分型。

表2 限制性内切酶

1.5 统计分析 计算基因频率以及基因型频率，进行遗传多态性分析并利用SPSS 软件的一般线性模型进行方差同质性检验以及单因素方差分析，单因素方差分析结果用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 SNPs筛选 通过测序筛选到3个SNP位点：g.1731G＞A、g.2044T＞C、g.3531C＞T（图1），对3 个位点进行基因分型。

图1 AMH 基因的SNP 位点鉴定

2.2AMH基因PCR-RFLP 结果 将186 个黑羽番鸭血液DNA 样本进行PCR 扩增后，用限制性内切酶消化目的片段，进行酶切分型。其中，g.1731G＞A 可以分为GG、GA、AA 3 种基因型（图2）；g.2044T＞C 可分为TT、TC、CC 3 种基因型（图3）；g.3531C＞T 可分为CC、CT、TT 3 种基因型（图4）。

图2 g.1731G＞A 电泳图

图3 g.2044T＞C 电泳图

图4 g.3531C＞T 电泳图

2.3 SNP 突变位点群体遗传参数分析 对AMH基因的基因型频率、基因频率、多态信息含量（PIC）、遗传纯和度（Ho）、遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）进行统计分析，结果见表3。经哈迪温伯格平衡检测3 个位点均处于平衡状态，在g.1731G＞A 位点中G 为优势等位基因，AG 为优势基因型，基因型频率为AG＞GG＞AA；在g.2044T＞C 位点中，T 为优势等位基因，基因型频率为CT＞TT＞CC，在产蛋和体重性状中，CC 为优势基因型；在g.3531C＞T 位点中，C 为优势等位基因，基因型频率为CC＞CT＞TT。通过计算遗传参数，g.1731G＞A、g.2044T＞C、g.3531C＞T 位点的PIC在0.25～0.50，均为中度多态，g.1731G＞A 纯和度略高，杂合度略低，在群体中等位基因分布不均匀。

表3 AMH 基因群体遗传参数

2.4AMH基因多态性与产蛋性状和体重的关联分析 将基因型与产蛋数据以及体重数据进行方差齐性检验后进行单因素方差分析，结果见表4。在分析结果中，在g.1731G＞A 位点，番鸭300 日龄时，AG 基因型产蛋数显著高于AA，AG 为优势基因型，280 日龄体重均值约为3.1 kg，在不同基因型之间的体重均值无显著差异，A/G 突变和体重不相关。在g.2044T＞C 中，CC 基因型产蛋数显著高于TC 和TT 型，CC 型体重显著高于TT 型，CC 为优势基因型。在g.3531C＞T 中，3 种基因型的平均产蛋数约为44 枚，体重约为2.6 kg，不同基因型的产蛋数和体重均值无显著差异。

表4 AMH 基因型与产蛋数和体重的相关分析

3 讨 论

AMH 是TGFβ超家族成员，其主要受体为TGFβI 型受体和TGFβII 型受体[20]，与受体结合后主要通过Smad、MAPK、PI3K/Akt 等多种途径发挥作用[9]。AMH 由生长中卵泡的颗粒细胞分泌，在原始卵泡启动中起抑制作用。若卵巢中AMH 不表达，会导致卵巢储备过早耗尽[21]，推测AMH 与黑羽番鸭繁殖性能有着密切关系。一些研究证明荷斯坦母牛中AMH 的基因组遗传力与繁殖性状有着重要联系[22-24]。AMH 水平在许多哺乳动物[25-29]中已经成为预测卵巢储备的代表。

研究基因的单核苷酸多态性引起的氨基酸变异对理解基因型和表型之间的关系具有重要意义[30]。本实验对AMH基因在黑羽番鸭中进行SNP 鉴定，只检测了5'UTR 以及CDS 区和3'UTR 的SNP 位点，发现了3 个SNP 位点。根据哈迪温伯格平衡定律检测，g.1731G＞A（CDS 区）、g.2044T＞C（CDS 区）、g.3531C＞T（3'UTR）位点处于平衡状态。本实验中，对AMH基因在CDS区域的SNP（g.1731G＞A、g.2044T＞C）位点进行分析，发现g.1731G＞A 位点G（GTA）突变至A（ATA）导致AMH编码的第280 个氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸。薄秀梅等[31]研究发现MEKK3 中K391 的氨基酸突变引起蛋白结构和功能的改变。锁培苏等[32]在卵巢早衰患者中发现AMH 蛋白第372 位氨基酸由丙氨酸突变为酪氨酸，该位点的突变与卵巢早衰具有相关性。本实验对AMH 的单核苷酸多态性位点与产蛋性状和体重性状进行关联分析，同时关注SNP 位点的产生是否导致氨基酸的变化。本实验结果表明，AA 基因型的平均产蛋数显著低于AG 基因型，AA 型个体表型处于劣势，AG 型个体表型处于优势，为黑羽番鸭育种工作提供理论参考。通过expasy.org 网页分析突变前后的氨基酸序列发现，G 变为A 导致缬氨酸含量由5.7%变为5.5%，异亮氨酸含量由11% 变为12%，这2 个氨基酸均为疏水性氨基酸，突变前后总平均亲水性不变，AMH编码的蛋白质不稳定系数均为54.01（将不稳定系数小于40的蛋白判定为能够在体外稳定存在），可能间接影响了蛋白质的空间结构，AMH基因的单核苷酸突变可能影响了AMH 和AMHR2 互作[33]。本研究中，g.1731G＞A 位点中AG 基因型的产蛋数均值显著高于AA 型，但对体重的影响不显著，在g.2044T＞C 位点中，CC 基因型在产蛋和体重性状上都有显著优势，番鸭中g.1731G＞A和g.2044T＞C 突变位点可作为遗传标记参考基因。通过对AMH基因的5'UTR 及3'UTR 区域的SNP 检测，发现g.3531C＞T 位点位于3'UTR 区，CC 基因型频率显著高于TT 型，但该位点突变对产蛋和体重的影响不显著。

本研究中g.1731G＞A 和g.2044T＞C 的突变位点均与产蛋性状相关，g.2044T＞C 的突变位点与体重相关，AG 基因型和CC 基因型可作为新一代黑羽番鸭育种的候选基因型，但由于产蛋和体重性状受到多种因素影响，所以g.1731G＞A 位点和g.2044T＞C 位点对AMH 蛋白功能的影响有待深入研究。

4 结 论

本实验结果表明，AMH基因存在g.1731G＞A、g.2044T＞C、g.3531C＞T 3 个SNPs 位点。其中，g.1731G＞A的AG 和g.2044T＞C 的CC 为优势基因型。g.1731G＞A和g.2044T＞C 与产蛋性状相关，g.3531C＞T 与产蛋性状不相关，g.2044T＞C 与体重性状相关，g.1731G＞A 和g.3531C＞T 与体重性状不相关。在哺乳动物中，AMH已经被证实可以作为预测卵巢储备的标志物，但其是否可以作为黑羽番鸭繁殖性能的遗传标记，还有待生产实际进一步验证。