非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范

本规范适用于非洲猪瘟病毒流行毒株与非洲猪瘟病毒CD2v 和MGF 360-505R 基因缺失株的荧光PCR方法鉴别检测。

1 主要试剂

1.1 核酸提取试剂盒。

1.2 无核酸酶水。

1.3 荧光PCR预混液（2×）。

1.4 引物和探针：P72、CD2v、MGF360-505R 基因扩增引物和探针由国家非洲猪瘟参考实验室设计并提供（联系人：李林，电话：0532-87839188）。

1.5 阳性和阴性对照：阳性对照样品为ASFV 基因组DNA 标准物质（用无核酸酶水稀释1 000 倍后使用），由国家非洲猪瘟参考实验室提供；阴性对照样品为无核酸酶水。

2 主要仪器设备

2.1 荧光PCR扩增仪。

2.2 台式低温高速离心机。

2.3 组织匀浆机。

2.4 微量可调移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL等不同规格）。

2.5 无核酸酶离心管与吸头。

2.6 PCR扩增管。

3 样品采集和运输保存

对活猪，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；对病死猪或已屠宰猪，可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织。尽快送至实验室进行病毒核酸检测。

样品的运送与保存应满足NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》相关要求。上述样品可在4 ℃下最长保存2 d；如需长时间保存，应置于-20 ℃以下。

4 样品处理

4.1 组织样品 取0.1～0.2 g样品，加入1～2 mL预冷的PBS（pH 7.4），用组织匀浆机高速匀浆，制成10%组织匀浆液，以5 000 r/min 离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。

4.2 液体样品 抗凝全血、血清等液体样品不需进行特殊处理，直接取200 μL进行核酸提取。

5 病毒核酸的提取和纯化

取已进行前处理的样品200 μL，可按传统方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取试剂盒、自动化核酸提取仪提取病毒核酸。提取后的病毒核酸应立即使用或置于-20 ℃以下冷冻保存。每次抽提核酸，应包括一个阳性对照样品和一个阴性对照样品。

6 荧光PCR检测

6.1 荧光PCR反应液制备 在灭菌的离心管中制备符合检测样品数量（包括阳性、阴性对照）要求的荧光PCR反应混合液，至少额外制备两个样品的量。每个样品配制20 μL PCR 反应混合液，组成如下：7.5 μL P72、CD2v、MGF360-505R 基因引物、探针预混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探针分别用FAM、VIC 和Cy5 进行标记），12.5 μL 2×探针法荧光PCR预混液。

分别取20 μL PCR 反应混合液加至每个PCR 扩增管中；再分别取5 μL DNA 模板加入到PCR 扩增管中。每次进行荧光PCR 扩增时均应设立阳性、阴性对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板。加入模板后，密封PCR扩增管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放在荧光PCR仪中。按下述条件运行扩增程序。

6.2 荧光PCR 扩增条件 50 ℃孵育2 min；95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，45 个循环，在每一循环的60 ℃时收集FAM、VIC和Cy5通道中的荧光信号。

6.3 结果分析 Ct 值由荧光PCR 仪的软件自动确定。

6.3.1 试验成立条件 阳性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均＜35且出现特异性扩增曲线，阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因无Ct 值或阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且无特异性扩增曲线，判为试验有效。试验无效时应重新进行试验。

6.3.2 P72、CD2v、MGF 360-505R 基因检测结果判定

6.3.2.1 P72基因检测结果判定（FAM通道）被检样品Ct 值≤38 且出现特异性扩增曲线，判为ASFV P72基因检测阳性；无Ct值或Ct值≥40，判为ASFV P72 基因检测阴性；38＜Ct 值＜40 且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1 次复检，做3 个重复。至少2 个重复的Ct 值＜40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV P72基因检测阳性，否则判为ASFV P72基因检测阴性。

6.3.2.2 CD2v基因检测结果判定（VIC通道）被检样品Ct 值≤38 且出现特异性扩增曲线，判为ASFV CD2v 基因检测阳性；无Ct 值或Ct 值≥40，判为ASFV CD2v 基因检测阴性；38＜Ct 值＜40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1 次复检，做3 个重复。至少2 个重复的Ct 值＜40 且出现特异性扩增曲线即判为ASFV CD2v 基因检测阳性，否则判为ASFV CD2v基因检测阴性。

6.3.2.3 MGF 360-505R 基因检测结果判定（Cy5通道）被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性；无Ct 值或Ct 值≥40，判为ASFV MGF 360-505R 基因检测阴性；当38＜Ct值＜40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1 次复检，做3个重复。至少2个重复的Ct值＜40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性，否则判为ASFV MGF 360-505R 基因检测阴性。

6.3.3 综合判定 结合P72、CD2v、MGF 360-505R等3个基因的检测结果进行综合判定。具体判定标准见表1。

表1 综合判定标准