马蹄皮和陈皮资源化利用及果皮总黄酮协同抗菌抗氧化活性研究

张伟伟 宋平 李婉珍 金伟豪 李航航 朱龙宝 葛飞 陶玉贵

(安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽 芜湖 241000)

黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗肿瘤等功效，是具有一定研究价值的活性化合物，大多数黄酮类化合物从植物中提取。大多数药食同源植物都含有大量的黄酮类化合物，而且没有被资源化利用。药食同源的荸荠又称马蹄，不仅营养丰富，且具有多种活性物质[1,2]。据报道，马蹄皮中含有大量的黄酮类活性物质，然而马蹄加工成饮料后的果皮，未能得到合理利用，造成资源的极大浪费。目前国内对马蹄皮的研究，主要集中于马蹄果实的加工，近些年虽对马蹄皮提取物的抗菌抗氧化活性也有少量研究[1,3,4]，但利用马蹄皮中黄酮类化合物与其它药食同源植物中的黄酮类化合物进行协同活性研究尚未报道。同样为药食同源的陈皮富含黄酮类化合物，但是大量的柑橘在被加工成果汁后，其果皮被废弃不用。为实现废弃橘皮资源化利用,深入对橘皮中黄酮类化合物进行研究,以提高橘皮的综合利用价值[5,6]。

本文以乙醇为溶剂，采用超声辅助提取法分别从马蹄皮和陈皮中提取总黄酮化合物，利用芦丁标准曲线明确提取总黄酮浓度。马蹄皮和陈皮中含有的黄酮亚类不同，复配后的协同抗氧化抗菌活性的变化具有一定的研究意义[7]。研究马蹄皮和陈皮中总黄酮不同比例的抗氧化抗菌活性，可以为实现药食同源的马蹄皮和陈皮资源化，为有效开发和利用废弃果皮，并为马蹄皮和陈皮在食品和药品领域的应用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料与设备

新鲜马蹄果产自安徽省芜湖市无为市；芸香甙标准品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH，>97%)标准品、ABTS(>98%)、AB-8大孔树脂、硫酸亚铁、邻羟基苯甲酸、双氧水、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硝酸铝、亚硝酸钠、氨苄青霉素和卡那霉素均从阿拉丁试剂(上海)有限公司购买；其它所用试剂均是分析纯。大肠杆菌(ATCC 11303)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、枯草芽孢杆菌(ATCC 2233)、四链球菌(ATCC 2835)来自安徽工程大学生物与食品工程学院。

1.2 试验方法

1.2.1 马蹄皮和陈皮总黄酮提取

自水果超市购买新鲜芦柑，剥去柑皮即为陈皮，干燥备用。取新鲜马蹄果，剥皮干燥，备用。将干燥的陈皮和马蹄皮经粉碎机粉碎，过80目筛，得到马蹄皮粉末和陈皮粉末。取上述粉末各100mg，分别加入300mL85%乙醇溶液，于温度30℃，超声功率300W条件下超声60min，将提取液于10000转·min-1离心10min，收集上清液。收集沉淀物继续上述乙醇超声提取操作，合并滤液，使用旋转蒸发仪将粗提液旋蒸，即为总黄酮粗提液。将上述总黄酮粗提液，通过AB-8大孔树脂纯化收集得到总黄酮溶液，为待测样液[8]。将陈皮与马蹄皮总黄酮按照浓度比3∶1、1∶1、1∶3混合(以下浓度比均为陈皮总黄酮∶马蹄皮总黄酮)。

1.2.2 绘制标准曲线

准确称取0.5g芸香甙标准品，用80%乙醇溶解并定容至100mL，得到5.0mg·mL-1芸香甙标准品母液。分别取0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL芦丁标准溶液于试管中，添加80%乙醇至10mL。分别取上述溶液1mL，分别向各试管中加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，静置10min后，加入10%硝酸铝溶液0.3mL，静置6min后，加4%氢氧化钠溶液2mL，加蒸馏水至待测混合液总体积为5.0mL，振荡混匀后静置3min，于508nm处测定吸光度值，试验重复3次取平均值，将吸光度作为纵坐标，浓度(mg·mL-1)作为横坐标绘制标准曲线。根据标准曲线，分别通过紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)测定马蹄皮和陈皮提取液的总黄酮吸光度，换算出二者提取液中黄酮的浓度。

1.2.3 最小抑菌浓度试验

大肠杆菌(革兰氏阴性菌)、枯草芽孢杆菌、四链球菌和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)菌种均使用LB培养基。液体培养使用LB液体培养基，于37℃过夜培养。将活化培养的菌种再以(1∶40)的比例重新接种到新鲜LB液体培养基中继续培养，培养条件是37℃，时间为2～3h，当菌液的紫外吸收OD600nm达到0.5，此时细胞处于对数期。

通过微量稀释法测定不同质量分数马蹄皮总黄酮和陈皮总黄酮水溶液最小抑制浓度值(MICs)，阳性对照药物为氨苄青霉素和卡那霉素。简言之，将对数期大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌细胞接种于含有不同药液的试管中，并在37℃下温育12h。MIC值定义为可抑制细菌生长的最低药物浓度，每组重复3次，取平均值[9]。

1.2.4 抑菌圈试验

取对数期的大肠杆菌菌液100μL于固体LB培养基中进行涂布，使用药敏片中含有质量分数为10%的马蹄皮总黄酮、陈皮总黄酮、3∶1(陈皮总黄酮∶马蹄皮总黄酮)、1∶1(陈皮总黄酮∶马蹄皮总黄酮)和1∶3(陈皮总黄酮∶马蹄皮总黄酮)分别放置于含每种细菌的固体培养基中，将不含药物溶液的PBS组药敏片设定为空白组，培养24h后测定抑菌圈直径，试验重复3次取平均值[10]。

1.2.5 DPPH自由基清除率测定

参考Rodrigo Scherer等的方法，用80%乙醇配制总黄酮浓度分别为1μg·mL-1、2μg·mL-1、4μg·mL-1、8μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1的总黄酮溶液(陈皮总黄酮∶马蹄皮总黄酮=3∶1、1∶1、1∶3)，相同浓度的VC溶液设置成对照组，各取2mL于试管中，加入2mL 0.2mM DPPH溶液，摇匀，室温下避光反应30min，测定反应样液在517nm处吸光值记为Ai，以无水乙醇替代DPPH溶液，测定吸光度值记为Aj，以无水乙醇替代样品溶液，测定吸光度值记为A0，测量3次取平均值，计算DPPH自由基清除率的公式[11]：

DPPH自由基清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

1.2.6 ABTS+·清除率测定

将ABTS溶液(10mL、7mM)和过硫酸钾溶液(10mL、4.9mM)混合后摇匀，室温条件下遮光过夜保存，得到ABTS+·储备液。使用时取储备液稀释，于734nm处测定吸光度值，现配现用。参考吕平等的方法，用80%乙醇配制总黄酮浓度分别为5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1总黄酮溶液(陈皮总黄酮∶马蹄皮总黄酮=3∶1、1∶1、1∶3)，配制相应浓度的VC溶液。取200μL各样品于试管中，加入4mL ABTS+·溶液，振荡摇匀，室温下下避光反应 6 min，于734 nm处测定吸光度值记为Aw，以无水乙醇替代ABTS+·溶液，测定吸光度值记为Ae，以无水乙醇替代样品溶液，测定吸光度值记为Aq，测量3次取平均值。计算 ABTS+·清除率的公式[12]：

ABTS+·清除率=[Aq-(Aw-Ae)]/Aq×100%

1.2.7 统计学分析

应用SPSS软件进行方差回归分析，计算自由基的半清除率浓度IC50值。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

芦丁作为黄酮类化合物标准品进行芦丁标准曲线方程为Y=1.9659X，R2=0.9992，结果呈现显著线性相关。通过检测陈皮和马蹄皮提取总黄酮在508nm处吸光度值，并对照标准曲线可知，陈皮总黄酮含量为45.735mg·L-1，马蹄皮的总黄酮含量为40.58mg·L-1。

2.2 马蹄皮和陈皮总黄酮的紫外光谱

马蹄皮、陈皮和芦丁标准品测得的紫外可见光谱结果如图2所示，通过标准品结果可知，黄酮类的化合物，其甲醇溶液的特征峰位置为360nm。根据马蹄皮和陈皮中黄酮提取结果的紫外可见光谱扫描结果可知，二者的特征峰位置均和芦丁黄酮中的类似，说明从马蹄皮和陈皮中提取出的化合物确实为黄酮类化合物。

2.3 马蹄皮和陈皮总黄酮的抑菌活性

黄酮类化合物可作为一种有效的抗菌类药物，在体外抑菌活性使用中常常呈现出高效的抑菌活性。药食同源马蹄和陈皮往往表现出抗菌消炎的功效，主要作用机制是马蹄皮和陈皮中总黄酮的存在，因此研究马蹄皮和陈皮抗菌抗氧化活性，首先进行抑菌活性筛选试验，进行MIC试验测试。使用马蹄皮和陈皮中总黄酮进行MIC测试，MIC试验方法分别对4种常见的细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、四链球菌和金黄色葡萄球菌)进行抑菌活性筛选。结果表明，马蹄皮和陈皮总黄酮对多种细菌都表现较强的抑菌活性，见表1，说明具有广谱的抗菌活性。结果表明，马蹄皮总黄酮对上述4种细菌的MIC值分别为17.33±0.67μg·mL-1、22.0±0.25μg·mL-1、20.0±0.32μg·mL-1和26.67±0.37μg·mL-1；陈皮总黄酮对上述4种细菌的MIC值分别为19.33±0.72μg·mL-1、18.0±0.45μg·mL-1、16.67±0.81μg·mL-1和22.0±0.98μg·mL-1。综上可知，马蹄皮和陈皮总黄酮表现广谱的抗菌活性，对大肠杆菌效果最好，因此进一步使用CFU法验证马蹄皮和陈皮总黄酮对大肠杆菌的抗菌活性。

表1 最小抑菌浓度试验

如图3所示，马蹄皮总黄酮、陈皮总黄酮以及二者不同比例的混合物的抑菌圈试验结果，PBS处理组设置成空白组。图3A为抑菌圈结果图，从图中可知，质量分数为10%的马蹄皮总黄酮和陈皮总黄酮都表现出对大肠杆菌的抑制作用，但是效果不明显，可能原因是总黄酮的浓度较低。通过观察不同比例的马蹄皮总黄酮和陈皮总黄酮抑菌圈结果可知，当马蹄皮总黄酮和陈皮总黄酮为1∶3时，展现的抑菌效果最明显。由图3B结果可知，抑菌圈直径由小到大依次为陈皮总黄酮(9.2mm)<马蹄皮总黄酮(10.1mm)<3∶1(11.6mm)<1∶1(12.0mm)<1∶3(14.5mm)。综合图3结果可知，当马蹄总黄酮的比例提高后，其组合物的抑菌活性明显提高，说明马蹄总黄酮比陈皮总黄酮的抑菌活性高，同时二者之间具有协同抑菌活性。

2.4 马蹄皮和陈皮总黄酮的DPPH自由基清除能力评估

DPPH醇溶液与黄酮类化合物作用后，通过溶液颜色的深浅可判断DPPH的清除功效，不同质量分数的马蹄皮总黄酮和陈皮总黄酮和VC对比观察清除DPPH自由基能力结果如图4所示。随着试剂浓度增加，DPPH自由基被清除效率增大。经SPSS分析可知，DPPH自由基半清除浓度由小到大依次为3∶1(IC50=3.83±0.12μg·mL-1)<1∶1(IC50=3.57±0.21μg·mL-1)<1∶3(IC50=3.37±0.15μg·mL-1)<陈皮总黄酮<马蹄总黄酮1∶3>3∶1。

表2 DPPH自由基半清除浓度的统计学分析结果

2.5 马蹄皮和陈皮总黄酮的ABTS+·自由基清除能力评估

ABTS+·溶液与黄酮类化合物作用后，通过检测溶液吸光度大小可判断ABTS+·的清除功效，不同质量分数的马蹄皮总黄酮和陈皮总黄酮和VC对比观察清除ABTS+·自由基能力结果如图5所示。随着样品浓度增加，ABTS+·自由基清除率增大且逐渐趋于平缓。经SPSS分析可知，ABTS+·自由基半清除浓度由小到大依次为3∶1(IC50=9.60±0.21μg·mL-1)<1∶1(IC50=13.21±0.15μg·mL-1)<1∶3(IC50=14.53±0.12μg·mL-1)<陈皮总黄酮<马蹄总黄酮1∶3>3∶1。

表3 ABTS+·自由基半清除浓度的统计学分析结果

3 讨论

根据研究结果可知，马蹄皮和陈皮中都含有丰富的黄酮类化合物，陈皮总黄酮含量为45.735mg·L-1，马蹄皮的总黄酮含量为40.58mg·L-1，陈皮中总黄酮含量略高于马蹄皮总黄酮。通过CFU试验结果表明，当马蹄皮总黄酮和陈皮总黄酮按不同比例混合时，其对大肠杆菌的抑菌活性有明显提高，说明二者之间的复配均有协同抑菌活性。同样类似的协同活性也体现在抗氧化活性研究中，各组自由基清除率试验中γ均小于1，且有显著性差异，表明马蹄皮和陈皮总黄酮具有协同抗氧化作用，且不同的复配比对同种自由基的清除效果有差异。本文只进行3种浓度比例的抗菌抗氧化活性研究，数据量不够，需要进行大量复配比例以及重复性研究，相关抗菌抗氧化活性内容不够充分，需要通过在动物水平试验进一步验证二者的协同活性。