金属有机纳米粒的制备及其在高强度聚焦超声治疗小鼠肝癌中的增效作用

叶合敏,黄 楠,孙廷宇,侯 伟,白 晋,李桦楠

超声医学工程国家重点实验室//重庆医科大学生物医学工程学院,重庆400016

高强度聚焦超声(HIFU)肿瘤治疗系统,是将体外低能量超声波聚焦于体内靶区,在肿瘤内产生瞬态高温(60 ℃以上)、空化、机械作用等生物学效应,使靶区内的肿瘤组织发生凝固性坏死［1］。然而,由于超声传播过程中能量的衰减,造成焦域内能量沉积不足,导致HIFU治疗肿瘤存在消融不全面、不能彻底消除残留肿瘤细胞的问题［2-5］。

近年来,利用纳米粒改变组织声场用于HIFU增效和联合治疗成为当下研究的热点［3-4,6］。传统的HIFU增效剂(SAs)如微泡(MBs),体积较大,仅允许肿瘤微血管内循环,不能渗透肿瘤组织内部［7］。同时,由于微泡稳定性差、体内半衰期短,使得空化控制困难、沿声束路径组织损伤［8］。为了解决这些问题,研究人员通过引入精心设计的有机/无机载药纳米粒(NPs)［9-11］改变肿瘤组织的声环境并将药物携入肿瘤组织,从而增强HIFU疗效。例如,氟碳纳米粒作为高强度聚焦超声(HIFU)增效剂已被广泛研究［7,12］,但通常需要外部的激发产生气泡进而对肿瘤进行增效治疗,且增效持续性不如内源性产生的气泡持久［13-14］。其次,脂质体、胶束等有机纳米粒的体内循环周期短［15］,无机纳米粒普遍具有毒副作用且生物降解较差［13］。有研究表明,直接使用化疗药物通过无机和有机组分间的配位作用构建金属有机纳米粒［16-18］具有尺寸分布可控、骨架可调节、高载药率等［19-22］独特优势,并在药物递送、光热疗法和医学成像等方面显示出巨大的潜力［4,7,16-17］。

本研究通过物理吸附将葡萄糖氧化酶(GOD)、二氧化锰(MnO2)、三价铁离子(Fe3+)、化疗药物盐酸阿霉素(DOX·HCl)制备成金属有机纳米粒GOD-MnO2-Fe3+-DOX(GMFD NPs)。该纳米粒在体内循环中可稳定存在,并通过高通透性和滞留效应(EPR)在肿瘤组织大量聚集,受到肿瘤弱酸性微环境刺激后解离,从而实现药物的有效释放［23］。在HIFU治疗过程中,该纳米粒解离释放的MnO2可在肿瘤弱酸性条件下与原位产生的H2O2反应,产生O2以增效HIFU治疗。同时,GMFD NPs解离释放的GOD可消耗肿瘤部位的葡萄糖产生的H2O2进一步促进O2的产生,释放的DOX可治疗HIFU消融后残余的肿瘤细胞。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂 聚烯丙胺盐酸盐[PAH(15 k Da)]、盐酸阿霉素(DOX)、葡萄糖氧化酶(GOD)、二甲基亚砜(DMSO)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)。磷酸盐缓冲液(PBS)、透析袋(分子量为3.5 kDA)购自重庆奥怡生物科技有限公司。FeCl3·6H2O、KMnO4由重庆医科大学设备处提供。

1.1.2 实验仪器 磁力搅拌器(B13-3,上海沉汇仪器有限公司)、万分之一天平、超声波破碎仪(YCY-500,上海研永超声设备有限公司)、超声波清洗仪、高速离心机(H3-18K,湖南可成仪器设备有限公司)和紫外可见分光光度计(Nanodrop 2000/2000C,美国赛默飞世尔科技有限公司)、Milli-Q超纯水仪(上海摩速科学器材有限公司)、溶氧仪YSI 550A(成都锐新仪器仪表有限公司)由超声医学工程国家重点实验室提供。透射电子显微镜(JEM-1400PLUS)由重庆医科大学生命科学研究院公共平台提供的。超高速离心机(SorvallTMWX+,Thermo Fisher Scientific)和马尔文激光粒度仪(Zeta SIZER 3000HS,USA)由重庆医科大学药学院公共平台提供。X射线光电子能谱(XPS)仪(ESCALAB250Xi,Thermo Fisher Scientific)由重庆大学分析测试中心提供。

1.1.3 实验细胞 人HepG2肝癌细胞购自上海富衡生物科技有限公司。将细胞培养在在10%胎牛血清(FBS)、90%DMEM 培养基、1%青霉素-链霉素抗生素中于37 ℃,5%CO2孵箱培养。当细胞生长达到70%～80%时,对细胞以1∶2～3传代并进行细胞实验。

1.1.4 实验动物 雌性裸鼠,4～6周龄,体质量17～23 g,购于重庆医科大学实验动物中心。动物饲养和实验均遵循动物保护组织的相关规定以及重庆医科大学动物中心的使用规范。将HepG2细胞(0.2 mL,PBS中1.5×107z/mL)注射到裸鼠背部的皮下组织中以建立肿瘤模型。

1.2 方法

1.2.1 MnO2纳米粒的合成 通过直接混合高锰酸钾(KMnO4)和聚电解质(PAH)水溶液制备MnO2纳米粒［24］。具体方法如下:4.99×10-3mmolPAH(74.8mg,2mL,37.4 mg/mL)水溶液与0.40 mmol KMnO4水溶液(63 mg,18 mL,3.5 mg/mL)混合,在室温下搅拌反应15 min。然后用超高速离心机离心1 h(41 k r/min)并用超纯水洗涤3次,离心结束后取出置于50 mL离心管中。用超声波破碎仪作用1 h(on 9.9 s,off 2 s,30 min/次,2次),然后储存于4 ℃待用。通过紫外可见分光光度计(UV-Vis)特征峰分布及X射线光电子能谱仪分析反应产物的XPS 能谱证明MnO2纳米粒子的合成,用激光粒度仪(DLS)研究MnO2纳米粒子的粒径。为了测试MnO2生成O2的能力,向MnO2溶液(棕色)中加入H2O、H+和H2O2,观察各离心管中的现象；在等量MnO2溶液中添加不同浓度的H2O2后,用溶氧仪检测不同时间点的O2浓度以评估氧气的产生。

1.2.2 GMFD NPs的构建 GOD和MnO2通过物理吸附形成不稳定絮状物,再与Fe3+形成稳定的网格状复合物(GOD-MnO2-Fe3+),随后将化疗药物DOX·HCl进一步与GOD-MnO2-Fe3+网格状复合物反应,通过DOX·HCl去质子化由亲水性转化为疏水性,使反应体系不断压缩形成致密的球状纳米粒子［23］。具体方法如下:先取1 mL MnO2(10 mg/mL)(0.115 mmol)与1 mL GOD(2 mg/mL)混合于15 mL离心管中,超声清洗仪作用15 min后离心5 min(10 000 r/min),去上清,沉淀用1 mL水重悬。然后取28.96 mg(0.107 mmol)Fecl3·6H2O溶于1 mL水中,超声助溶后加入GOD-MnO2混合物中,用超声清洗仪作用15 min,然后移入小棕瓶中搅拌反应45 min。最后称取10 mg DOX ·HCl超声作用下溶于1 mL 水中,剧烈搅拌(700 r/min 以上)下加入GODMnO2-Fe3+混合液中,搅拌反应2 h,静置过夜。次日取出反应产物,用去离子水透析(3500 MW)30 min,每15 min换一次水,然后放4 ℃冰箱保存。或将产物取出,真空冷冻干燥36 h,然后放4 ℃冰箱保存。

1.2.3 GMFD NPs的表征以及体外药物释放行为的研究

1.2.3.1 GMFD NPs 的基本理化性质 用透射电镜(TEM)和激光粒度仪(DLS)研究GMFD NPs的形态、粒径。

1.2.3.2 GMFD NPs中的DOX的载药量和包封率 分别取0.2 mLGMFD NPs原液+0.2 mL稀HCL溶液+0.8 mL DMSO,放至恒温摇床,37 ℃,100 r/min 摇晃至少2 h,然后用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)检测485 nm处的吸光度A485nm,并通过以下公式求出包封率、载药率［25］。

W1代 表GMFD NPs 内DOX 的 含 量,W2代 表GMFD NPs的总量,W3代表制备GMFD NPs所投入的DOX的总量。

1.2.3.3 GMFD NPs 体外药物释放实验 配置pH=2、pH=7.4的去离子水溶液,每组3个平行样。分别取1 mL GMFD NPs放入透析袋(3.5 k DA)中,用透析夹封口,将25 mL pH=2、pH=7.4 的水溶液倒入100 mL烧杯中,每个烧杯加入2 mL DMSO,再将装有GMFD NPs的透析袋放入烧杯中,将烧杯放至恒温摇床,37 ℃,100 r/min摇晃。分别于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、24、48 h时间点从烧杯中取样5 μL,每个样本取6次,并补充等量对应的溶液。采用紫外分光光度计测量在485 nm处的吸光值,根据标准曲线计算各组的浓度和药物累积释放量,分别计算各组在不同时间点的DOX 累积释放率(%),绘制时间-药物累积释放率曲线。

1.2.4 GMFD NPs体外与肿瘤细胞相互作用的研究

1.2.4.1 GMFD NPs 体外细胞毒性的测定 首先将HepG2细胞以104/孔接种到96孔板中,然后37 ℃,5%CO2孵箱培养24 h。然后配置含不同浓度(100、10、1、0.1、0.01、0 μg/mL)的DOX·HCl、GMFD NPs的DMEM培养基,加入孔中并共培养24 h。最后除去旧培养基,每孔加入0.1 mL 含CCK-8(5 mg/mL)的培养基,培养3 h后每孔用0.1 mL DMEM 培养基替换旧培养基,并通过酶标仪测吸光度值A450nm,通过以下公式求出细胞存活率。

细胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

As:实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、药物)

Ac:对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有药物)

Ab:空白孔(不含细胞的药物的培养基、CCK-8)。

1.2.4.2 GMFD NPs细胞摄取的评估 首先在HepG2细胞长到约70%后接种到35 mm×12 mm激光共聚焦细胞培养皿(Glass Bottom Cell Culture Dish,Φ20 mm)中,在37 ℃,5%CO2孵箱培养24 h。然后将原始培养基替换为含有DOX、GMFD NPs的培养基(浓度为DOX含量等效10 μg/mL)再培养4 h。最后用PBS冲洗2次,加200～400 μL Hoechst33342(Ex/Em=346 nm/460 nm)细胞核染料染色7 min,染色结束后,用PBS洗2次,并加1 mL PBS,在激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察GMFD NPs进入细胞的情况。

1.2.5 GMFD NPs体内安全性研究

1.2.5.1 GMFD NPs体外生物相容性研究 首先将健康雌性BALB/c小鼠眼眶取血,提取红细胞后与不同浓度的GMFD NPs共孵育4 h,观察红细胞溶血率,检测体内生物安全性。

1.2.5.2 GMFD NPs体内生物安全性评估 首先将健康雌性BALB/c小鼠随机分为3组(3只/组):A组(生理盐水组)、B组(DOX组)、C组(GMFD NPs组)。然后每3 d(1、4、7、10 d)注射1次药物(DOX等量10 mg/kg)。最后一次打药后隔天眼眶取血,检测血常规各项指标:白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白量(MCH)。

1.2.5.3 GMFD NPs体内药物代谢动力学研究 首先将6只体质量为180～220 g SD大鼠进行随机分为2组,分别为:A组(DOX组)、B组(GMFD NPs组)。大鼠尾静脉分别注射1 mL各组药(DOX等量10 mg/kg),分别在给药后0.5、1、2、4、8、24 h进行眼眶取血约0.5 mL。取出的血样置于1.5 mL 含肝素钠的抗凝血离心管中,在4 ℃,4000 r/min条件下离心10 min,取上清液0.1 mL加入0.8 mL的乙腈中,再次于4 ℃,4000 r/min条件下离心10 min,采用紫外分光光度法测得不同时间点血浆中的药物浓度,绘制药代动力学曲线以评价循环半衰期。

1.2.5.4 GMFD NPs增效HIFU治疗的实验研究 将12只HepG2 荷瘤裸鼠(肿瘤直径约10 mm)随机分为2组,每组6 只,分为生理盐水+HIFU 和GMFD NPs+HIFU 组(注射剂量为0.2 mL,DOX 的标准浓度为10 mg/kg)。经尾静脉注射给药4 h后以1%戊巴比妥钠腹腔麻醉裸鼠,对其肿瘤部位进行HIFU 定点消融。HIFU 治疗参数:治疗声功率为90 W,治疗总时间为3 s。然后观察辐照前后肿瘤消融后超声灰度值变化,并用自带Gray Val 1.0 软件计算靶区灰度变化值。在HIFU治疗结束后第1天,各组分别处死6只裸鼠,完整分离肿瘤组织,沿超声声束方向切开肿瘤,浸入37 ℃恒温水浴的2%TTC溶液中避光染色30 min。采用不规则体积测量软件HifuJupiter F计算各组凝固性坏死体积(Volume of coagulative necrosis,V),并根据公式计算能效因子(EEF),EEF代表HIFU 消融单位体积的肿瘤所需超声能量。式中η为超声换能器聚焦系数,本实验所用仪器η=0.7；P为辐照总声功率(W)；T 为辐照总时间(s)；V 为凝固性坏死体积(mm3)。EEF 值越小,代表HIFU 消融效率越高。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0 统计软件对所得结果进行独立样本t检验及单因素方差分析,数据以均数±标准差表示,用Origin 8做图,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MnO2 NPs的表征

反应前KMnO4对应的315 nm、525 nm和545 nm3个特征峰消失,出现了300 nm附近的MnO2宽平坦峰(图1)。分析产物的XPS光谱及XPS多重轨道光谱,出现C、N、O、Mn 等元素对应的峰值,在653.1 eV 和641.4 eV处观察到Mn 2p1/2、Mn 2p3/2两个特征峰(图2)。在将H2O2加入到MnO2溶液中后,产生了明显的气泡,而且在继续添加H2O2后,离心管中溶液颜色有棕色变为无色。而添加H+和H2O后的MnO2溶液没有明显的变化(图3)。在MnO2溶液中添加不同浓度的H2O2后,添加H2O2的MnO2组溶解O2浓度始终高于对照组,随着H2O2浓度的升高O2浓度随之升高,即使在模拟微环境的50 μmol/L 极低浓度的H2O2中也能产生O2(图4)。

图1 KMnO4和MnO2的紫外可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of KMnO4 and MnO2.

图2 MnO2 NPs的XPS光谱(A)和XPS多重轨道光谱(B)Fig.2 XPS spectrum(A)and XPS multiorbital spectrum(B)of MnO2 NPs.

图3 MnO2溶液添加H2O2、H+和H2O前后现象Fig.3 MnO2 solution before(A)and after(B)addition of H2O2,H+and H2O.

图4 MnO2与不同浓度H2O2作用产氧情况Fig.4 Oxygen production of MnO2 in the presence of 50,100 and 400 μmol/LH2O2.

2.2 GMFD NPs的理化表征及体外药物释放行为的研究

通过激光衍射粒度分析仪(DLS)测得的水溶液中GMFD NPs 各组成成分分别为:GOD 粒径约为8.71 nm,电位约为-5.56 mV；MnO2粒径约为45.75±1.99 nm,电位约为35.99±2.81 mV；GOD-MnO2(GM)粒径约为179 nm,电位约为-4.69 mV,而合成的GMFD NPs粒径约为131.23±0.84 nm,表面电位为21.87±1.72 mV,GMFD NPs 大小分散均一,呈圆球形,粒径大约为150 nm(图5～6)。用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)测得GMFD NPs负载DOX的载药率为40.18%。GMFD NPs 在pH=7.4 的溶液中非常稳定,在48 h 内释放的DOX仅有23.14%,但是在pH=2的酸溶液中,4 h内释放的药物便超过77.2%(图7)。

图5 GMFD NPs各组成成分粒径、电位分布Fig.5 Particle size and potential distribution of GMFD NPs components.A:Particle size of each component;B:Potential distribution of each component.

图6 GMFD NPs透射电镜图Fig.6 Transmission electron microscopy of GMFD NPs.

图7 GMFD NPs在不同pH溶液中的药物释放Fig.7 Drug release of GMFD NPs in solutions with different pH values(n=6).

2.3 GMFD NPs体外与肿瘤细胞相互作用的研究

cck-8细胞毒性实验结果显示,单纯DOX和GMFD NPs分别与肝癌细胞作用24 h后,对肿瘤细胞的抑制率都呈浓度依赖性,随着浓度的增加而增加(图8)。通过SPSS软件分析得出单纯DOX和GMFD NPs对细胞的半抑制浓度(IC50)分别为:5.850±0.274 mg/L 和1.135±0.183 mg/L。在激光共聚焦显微镜中可观察到,将HepG2肝癌细胞分别与单纯DOX、GMFD NPs共同孵育4 h后,各组的荧光强度无明显差异,均可被HepG2细胞内化摄取呈现红色DOX荧光信号(图9),流式细胞荧光检测结果显示单纯药物组与纳米粒组细胞内均检测到明显的DOX荧光,与激光共聚焦结果一致(图10)。

图8 不同浓度的DOX、GMFD NPs与HepG2细胞作用后的存活率Fig.8 Survival rate of HepG2 cells treated with DOX and GMFD NPs at different concentrations,n=6).

图9 DOX、GMFD NPs处理后细胞内DOX分布共聚焦图像Fig.9 Confocal images of intracellular DOX distribution in cells treated with free DOX and GMFD NPs.scale bar=100 μm.

图10 不同制剂细胞摄取流式荧光强度分析Fig.10 Fluorescence intensity analysis of cell uptake flow of DOX and GMFD NPs.A:Blank group;B:Free DOX group;C:GMFD NPs group.

2.4 GMFD NPs体内生物安全性及药物代谢动力学研究

当浓度低于100 μg/mL时,随浓度的增加,各样本溶血率均低于5%(图11)。虽然在高浓度100 μg/mL时的溶血率较高,可达12%,但在动物体内实验中我们所注射药物最高浓度为10 μg/mL,溶血率仅有1%。经BALB/c小鼠尾静脉注射生理盐水、单纯DOX 以及GMFD NPs10 d 后取血检测血常规各项指标(WBC、RBC、MCV、MCH),除单纯DOX组的WBC降低外(P=0.008),其余各组均无明显统计学差异(图12)。在注射药物后2 h内血液中DOX含量迅速下降,但GMFD NPs显示比游离DOX 更长的血液循环时间,注射24 h 后,有62.21%DOX 存留在血液里,而游离DOX 组仅有10.59%(图13)。

图11 不同浓度GMFD NPs与小鼠红细胞共培养的溶血现象观察Fig.11 Hemolysis of mouse erythrocytes co-cultured with different concentrations of GMFD NPs.

图12 注射不同试剂10 d后小鼠的的血常规Fig.12 Blood routine of mice injected with different reagents for 10 days(n=3,**P<0.01).

图13 DOX、GMFD NPs的药物代谢动力学研究Fig.13 Pharmacokinetics of DOX and GMFD NPs.

图14 HIFU消融前后裸鼠肿瘤区域的超声图像Fig.14 Ultrasonic gray-scale map of the target tumor area before and after HIFU ablation.A,B:Gray changes of ultrasound images before and after only HIFU ablation.C,D:Gray changes of ultrasound images before and after NPs+HIFU ablation.

2.5 GMFD NPs增效HIFU治疗的实验研究

HIFU 辐照后,裸鼠肿瘤组织靶区均出现不同程度增强的灰度增强,其中GMFD NPs 组灰度增强(25.5±4.50)明显高于生理盐水组(18.7±3.85),差异具有统计学意义(P=0.04)。HIFU治疗后24 h处死瘤鼠,取出肿瘤组织沿HIFU辐照时的声束方向切开组织,进行TTC染色,观察到消融后的凝固性坏死区域呈灰白色,而未消融区肿瘤组织成猩红色,边界清楚(图15)。GMFD NPs组凝固性坏死体积(105.80±1.21)明显大于生理盐水组(38.02±0.34)。能效因子(EEF)表示HIFU的消融效率,EEF值越低,HIFU的消融效率越高。通过计算可知,GMFD NPs组EEF(t=1.79)明显低于生理盐水组(t=4.97),各项差异均有统计学意义(P<0.001)。H＆E染色显示HIFU消融后的凝固性坏死区与非消融区边界明显,非消融区域肿瘤细胞形态完整,排列紧密,核大深染。细胞坏死区域细胞形态结构消失,呈片状红染,其中可见不规则排列的细胞核且核固缩、裂解。GMFD NPs+HIFU 辐照后坏死区核固缩、裂解较Saline+HIFU组更明显,且核结构消失,可见大量散在的细胞核碎片(图16)。

图15 HIFU消融后肿瘤组织靶区的凝固性坏死图片Fig.15 Coagulative necrosis in the target area in the tumor tissue after HIFU ablation.A:Saline+HIFU.B:GMFD NPs+HIFU.

图16 HIFU消融后肿瘤组织HE染色切片观察Fig.16 HE staining of tumor tissue after HIFU ablation.A:Saline+HIFU.B:GMFD NPs+HIFU.Scale bar=50 μm.

3 讨论

本实验首先合成MnO2纳米粒,结合紫外可见吸收光谱出现300 nm附近的MnO2特征峰［26］及产物的XPS光谱结果显示产物中锰的价态主要为+4 价［27］,表明MnO2NPs 的成功制备。图3、4 结果表明MnO2可与H2O2和H+反应,转化为Mn2+并产生O2,具体公式为:MnO2+H2O2+2 H+→Mn2++2 H2O+O2↑。即使在模拟微环境的50 μmol/L极低浓度的H2O2中也能产生O2,且随着H2O2浓度的升高O2浓度随之升高,为后文研究GOD氧化产生H2O2促进O2的产生提供理论支撑。然后构建了一种金属有机纳米粒(GMFD NPs),该纳米粒平均粒径为:131.23±0.84 nm,表面电位为21.87±1.72 mV,该NPs在中性环境下具有良好的稳定性,可限制负载药物的过早释放；而受肿瘤酸性微环境影响可快速触发GMFD NPs 的解离,释放出负载的DOX、GOD 和MnO2,并发挥其各自作用。从而有效地避免了非靶区药物释放引起的副作用。

实验中依次添加GOD、MnO2、Fe3+通过物理吸附、金属配位等方式以形成网状结构,加入DOX·HCl后通过去质子化不断压缩形成GMFD NPs［23,28］。流式细胞仪与激光共聚焦结果分别从定量与定性两个方面证明GMFD NPs能被肿瘤细胞有效摄取并释放抗癌药物。药物对细胞的半抑制浓度(IC50)是细胞抑制率达50%时所对应的药物浓度,可用来评估药物对癌细胞的毒性,其值越小,说明药物对细胞的毒性越强。体外细胞毒性实验结果表明GMFD NPs相比于单纯DOX对HepG2肝癌细胞具有更高的毒性。

药代动力学实验结果显示,GMFD NPs能显著提高药物在血液中的循环时间,并且能减少药物的提前泄露。在体外生物相容性研究中,使用了不同浓度的GMFD NPs与红细胞共同孵育考察其溶血率,结果显示该NPs在治疗剂量下的红细胞溶血率小于5%,表明该纳米粒具有良好的生物相容性。我们通过联合HIFU治疗瘤鼠肿瘤实验中发现,在相同实验条件下,GMFD NPs+HIFU组的靶区灰度值变化及凝固性坏死体积均大于仅HIFU消融组。能效因子(EEF)表示HIFU的消融效率,EEF值越低,HIFU的消融效率越高。通过计算可知,GMFD NPs 组EEF 明显低于生理盐水组,表明GMFD NPs可以有效提高HIFU的消融效率。H＆E染色结果显示GMFD NPs+HIFU组的靶区坏死明显,呈大片红染区域,细胞结构消失,坏死区与周围组织分界清晰,而生理盐水+HIFU组中仍然可见细胞碎片分布,部分细胞有完整形态结构。原因在于GMFD NPs能够通过EPR效应高效富集于肿瘤部位,从而改变肿瘤声学环境,增加超声能量的沉积［14］。同时在酸性条件下MnO2产生的O2提高了HIFU的空化效应,而空化效应本身所产生的高温又可以增加超声能量的沉积［29］,从而使HIFU的热效应与空化效应协同发挥作用。同时,由于MnO2纳米颗粒被分解为无害的水溶性Mn2+,可经代谢排出体外,因此,与许多其他不可生物降解的无机纳米材料不同,当MnO2应用于体内时,不存在长期毒性问题［30］。此外,由于该纳米粒包载抗癌药物DOX,可通过化疗诱导肿瘤细胞凋亡,清除残余的肿瘤细胞［31］。

综上所述,本实验成功制备了一种金属有机纳米粒(GMFD NPs)。该NPs具有良好的生物相容性,且低pH响应的特点可避免药物提前泄露,降低药物全身毒副作用。同时该NPs有效提高了HIFU消融效果,促进了肿瘤细胞凋亡。因此GMFD NPs可作为一种极具应用前景的HIFU增效剂。