miR-34a表达调控紊乱与抑郁障碍和抗抑郁疗效的关联研究☆

王俊彦 张兴磊 王纪智 张爱霞 杨春霞 刘志芬△ 张克让 孙宁△

在抑郁障碍病因学研究中，表观遗传是重要调控机制。 其中，微小 RNA（microRNA，miRNA）调控是重要环节之一。研究显示，miRNAs表达水平与抑郁障碍发病可能相关[1-4]。抗抑郁治疗可改变miRNAs及其下游靶点的表达[5-6]。因此，miRNAs不仅在抑郁障碍发病机制中发挥关键作用，而且可能为开发抑郁障碍治疗靶点提供新的途径[7]。本课题组前期研究发现miR-34b-5p、miR-34c-5p在抑郁障碍患者外周血中明显升高，且与抑郁严重程度呈正相关[8]。动物研究发现应激模型大鼠血浆miR-34a表达增强，而氟西汀可降低miR-34a表达水平[9]。以上研究结果提示miR-34a可能是影响抑郁障碍的关键miRNA。本研究通过比较抑郁障碍患者和正常对照外周血miR-34a的表达情况，及抗抑郁药物对miR-34a表达的影响，试图寻找相关的生物学标志，并为个体化抗抑郁治疗提供生物学预测指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2013年5月至2017年10月山西医科大学第一医院精神卫生科门诊、住院首发未用药抑郁障碍患者。纳入标准：①汉族，年龄18～60岁；②符合《精神障碍诊断与统计手册第四版 》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，Fourth Edition，DSM-IV）抑郁障碍诊断标准，经过2名精神科主治以上职称医师用中文版DSM-IV-TR轴I障碍用临床定式检查（SCIDI/P）为筛查工具一致诊断；③17项汉密尔顿抑郁量 表 （Hamilton depression scale，HAMD-17） 总分≥17分；④首次发病，未曾接受过精神科药物治疗、电休克或心理治疗。排除标准：①有严重自杀倾向或其他精神障碍病史；②存在酒精或其他精神活性物质依赖或滥用；③存在严重心脑血管疾病或其他躯体疾病；④妊娠或哺乳期女性。纳入100例首发未用药抑郁障碍患者，其中18例在随访过程中无法配合，予以剔除，最后82例抑郁障碍患者纳入分析。

对照组为山西医科大学第一医院精神卫生科招募的健康志愿者。纳入标准：①汉族，年龄18～60岁；②HAMD-17总分<7分；③无抑郁障碍发作史；④无精神疾病及精神疾病家族史；⑤入组前的1个月内未服用任何药物。排除标准：①存在酒精或其他精神活性物质依赖或滥用；②存在严重心脑血管疾病或其他躯体疾病；③妊娠或哺乳期女性。最终纳入60名健康志愿者。

本研究方案通过山西医科大学第一医院伦理委员会审查批准。所有患者及其家属和健康志愿者签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 量表评估 收集患者和对照年龄、性别、婚姻状况、家族史、物质滥用史等资料。治疗前和治疗8周末采用HAMD-17量表评估患者临床症状和疗效。根据治疗8周末HAMD-17总分判断患者是否临床治愈（临床治愈标准：HAMD-17总分≤7分），治疗是否显效（显效标准：HAMD-17总分减分率≥50%）。

1.2.2 药物治疗 抑郁障碍患者使用5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）类抗抑郁药治疗8周，主要药物为艾司西酞普兰（n=47）、舍曲林（n=23）和氟西汀（n=30）。从小剂量起始，根据个体临床症状逐步增加剂量，于4周末加到最大治疗剂量。研究期间睡眠障碍者可短期合用苯二氮艹卓类药物。

1.2.3 miR-34a表达检测 所有被试抽取4 mL空腹静脉血，于3500 rpm离心10 min，吸取血浆保存于-80℃冰箱。采用Trizol试剂提取外周血miRNA，分光光度计检测RNA的浓度和纯度。将提取的miRNA使用miRcDNA合成试剂，在42℃60 min、95℃ 5 min反应条件下反转录为cDNA。参照qRT-PCR反应试剂盒进行PCR反应。采用2-ΔΔCT法计算目标基因miR-34a相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS 23.0进行分析。年龄以均数±标准差（±s）描述，组间比较使用独立样本t检验。miR-34a表达水平采用中位数（下四分位数，上四分位数）[M（QL，QU）]描述，患者组和对照组、治愈组和非治愈组、显效组和非显效组比较采用Mann-Whitney U检验，治疗前后比较用配对样本Wilcoxon检验。采用Spearman相关分析miR-34a表达水平和抑郁严重程度的关系。构建受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分析miR-34a对抑郁障碍诊断的效能。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 一般人口学资料 患者共82例，男24例，女58例，年龄（34.78±10.96）岁。对照共 60名，男 20名，女 40 名，年龄（32.03±10.23）岁。 两组的年龄（t=-1.517，P=0.132）、 性别（=0.268，P=0.605）差异无统计学意义。

2.2 miR-34a表达水平 患者组miR-34a表达水 平为 9.12（3.85，51.34），对照组为 1.49（0.42，3.43），患者组高于对照组（Z=-7.099，P=0.001）。

2.3 患者治疗前后miR-34a表达水平 患者治疗后 miR-34a 表达水平为 8.98（2.88，28.66），较治疗前降低（Z=-2.140，P=0.032），但仍高于对照组（Z=-6.125，P=0.001）。

2.4 治愈组与未愈组、显效组与非显效组治疗前后的miR-34a表达水平 治愈组和未愈组的miR-34a表达水平治疗前差异无统计学意义（Z=0.939，P=0.335）， 治疗 8周后 miR-34a表达水平组间差异无统计学意义（Z=0.048，P=0.962）。见表1。显效组和非显效组的miR-34a表达水平治疗前差异无统计学意义（Z=1.356，P=0.175），治疗8周后miR-34a表达水平组间差异无统计学意义（Z=0.560，P=0.576）。 见表 2。

表1 治愈组与未愈组患者HAMD-17总分与miR-34a表达水平

表2 治疗显效组与治疗非显效组患者HAMD-17总分与miR-34a表达水平

2.5 miR-34a表达与抑郁障碍严重程度的关系相关性分析显示，所有患者治疗前miR-34a表达水平与HAMD-17评分相关性无统计学意义（r=0.043，P=0.701）。

2.6 miR-34a表达水平诊断抑郁障碍的ROC曲线 抑郁障碍外周血miR-34a表达水平区分抑郁障碍与对照的曲线下面积AUC=0.849（P<0.001，95%CI：0.787～0.911）， 当外周血 miR-34a 为 3.586（2-ΔΔCT值）时，约登指数为最大值0.618，此时的敏感度为76.8%，特异度为85.0%。见图1。

图1 外周血miR-34a对抑郁障碍诊断效能 以miR-34a值为检验变量，患者和对照分组为状态变量，绘制ROC曲线，AUC=0.849（95%CI：0.787～0.911）。

3 讨论

抑郁障碍是一种病因不明的精神疾病，目前仍缺乏客观的诊断工具，且治疗效果有限。找出抑郁障碍特异性的生物学标志物是目前临床上重要任务。这对提高抑郁障碍的诊断效率，开展抑郁障碍的精准治疗具有重要意义。大量证据表明遗传因素是抑郁障碍关键的发病因素，表观遗传学的发展为探明抑郁障碍的遗传机制提供了支持。miRNA作为重要的表观遗传机制之一，其表达谱已用于疾病诊断和新药的开发。在众多miRNA中，有研究表明miR-34a可能与抑郁障碍的发生有关。AZEVEDO等[10]发现miR-34a是在抑郁障碍、双相障碍和精神分裂症患者中均差异表达的miRNA，并在15例抑郁障碍患者和14名健康对照中发现，抑郁障碍患者死后脑组织前扣带回miR-34a表达水平明显下降。而本研究发现抑郁障碍患者外周血miR-34a的表达水平显著高于正常对照。这一研究结论与AZEVEDO等[10]基于前扣带回的研究结果不一致。出现结果不一致可能是由于检测方法不同，本研究检测的miR-34a是从 5'端的臂加工而来，与 AZEVEDO等[10]检测的miR-34a在基因结构上有差别。研究结果不一致也有可能是由于选取的组织差异造成。BAVAMIAN等[11]报道miR-34a在小脑表达上调。由此推测，miRNA表达具有组织特异性效应，未来需要加大样本量，进一步研究。在上述研究基础上，本研究以miR-34a表达水平为检验变量建构ROC曲线，结果显示miR-34a表达水平对诊断抑郁障碍有一定的价值。 miR-34a 为 3.586（2-ΔΔCT值）时，约登指数最大值为0.618，此时的敏感度和特异度分别为76.8%和85.0%。表明miR-34a表达具有对抑郁障碍的诊断价值。

本研究对82例抑郁障碍患者抗抑郁治疗前后miR-34a的表达水平变化进行分析，发现miR-34a治疗后表达水平降低。LOPEZ等[12]选取124例抑郁障碍患者进行为期8周的度洛西汀抗抑郁治疗，对治疗前后外周血miRNA进行小RNA测序，结果发现11个miRNA表达上调，7个miRNA表达下调。ZHOU等[13]用心境稳定剂对原代培养的大鼠海马神经元进行干预，结果发现大鼠海马miR-34a表达水平下降。这些研究表明，抗抑郁药物可能通过降低患者外周血miR-34a表达水平而发挥治疗作用。此外，本研究根据患者治疗后HAMD总分来判断患者的疗效，对不同临床结局患者的miR-34a表达水平进行分析，结果显示治愈组与未愈组、显效组与非显效组间的miR-34a表达水平均差异无统计学意义（P＞0.05），表明 miR-34a表达水平不能预测患者接受抗抑郁治疗后是否能治愈以及是否显效，miR-34a表达水平与抑郁障碍疗效尚未证明有关。

本研究样本量仍然偏小，对临床的诊疗建议仍显不足。未来需在长期追踪的更大样本中验证。此外，本研究仅从临床角度验证了外周血miR-34a对抑郁障碍的影响，未来还需要开展细胞、动物等多层面的基础实验研究，进一步明确miR-34a影响抑郁障碍的机制。