刺五加-云芝乙醇提取物对小鼠抗抑郁作用

王丽红，孟卓异，林丽颖，宫益霞，张 宇，孙长海，赵 宏

（佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯 154007）

抑郁症是一种常见的精神疾病，会对生活产生负面影响。三分之二的抑郁症患者会产生自杀念头，自杀率从10%～15%不等。基于1950年代单胺神经递质（如5-羟色胺或去甲肾上腺素）的偶然发现，到目前为止，对抑郁症的治疗完全取决于抗抑郁药，而这些抗抑郁药只对约50%的患者完全起效[1]。因此，迫切需要更有效的抗抑郁药。

刺五加为东北道地药材五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus（Rupr. et Maxim.） Harms）的干燥根及根茎或茎。在西伯利亚大河地区被称为“西伯利亚人参”，在中国、韩国、俄罗斯和日本普遍用作传统中草药[2−4]。刺五加的根、根茎和茎枝可以通过干扰抑郁症大鼠脑中五羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NE）关键酶的表达来产生抗抑郁作用[5]。云芝（Coriolus versicolor（L. ex Fr.） Quel）在东方医学中的应用历史悠久，也被称为“火鸡尾巴”，是一种专性需氧菌，常出现在树干、树枝、枯枝和树桩上。云芝早在《本草纲目》中就有记载，在中国已有超过400年的药用历史。云芝提取物具有多种生物学活性，包括抗微生物、抗病毒、免疫调节、保肝和抗肿瘤等[6−7]。

刺五加和云芝长期以来一直作为具有镇静催眠和提高免疫力的保健食品被广泛研究及应用[8−12]，但将两者进行配伍使用的研究尚无记载。刺五加作为宁心安神类药物在中国药典中记载的中药复方中仅有脑灵液一种。本课题将刺五加与云芝两者配伍使用，主要研究二者联用的抗抑郁作用、联用的最适剂量以及抗抑郁的作用机制，旨在获得一种天然的，毒副作用低的对抑郁症有治疗作用的保健药物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺五加及云芝 均采自黑龙江，经鉴定为正品；无水乙醇、冰乙酸 天津市凯通化学试剂有限公司；氯化钠注射液 吉林省都邦药业股份有限公司；利血平 阿拉丁试剂上海有限公司，≥99.5%；盐酸氟西汀 苏州中化药品工业有限公司；鼠5-HT ELISA KIT 、鼠去甲肾上腺素（NE）ELISA KIT、鼠白细胞介素IL-10、IL-1βELISA KIT 上海纪宁实业有限公司，批号：CK-E20162；实验动物为雄性昆明小鼠，体重18～22 g 由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，合格证书SCXK（黑）-2013-001。

台式低速离心机、酶标仪 赛默飞世尔上海仪器有限公司；FA2004型分析天平仪 上海越平科学仪器苏州制造有限公司；SK5210HP型超声波清洗器

上海科导超声仪器有限公司；FW-177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 刺五加和云芝按生药量配比分为刺五加组（AS）、云芝组（CV），刺五加和云芝不同配比组（AC-1:1、AC-1:2、AC-1:3、AC-1:4、AC-1:5、AC-5:1、AC-4:1、AC-3:1、AC-2:1），精确称取的各配伍比例的刺五加和云芝粉末共11.25 g，将原料粉末置于锥形瓶中，使用75%乙醇溶液为提取溶剂，液料比为25:1（mL/g），浸泡过夜后采用超声辅助提取法，超声功率120 W，提取时间2 h，提取液浓缩后使用生理盐水定容至25 mL容量瓶中，制成浓度为0.45 g/mL的混悬液，以待使用。。

1.2.2 动物分组给药及小鼠抑郁模型的建立

1.2.2.1 动物分组及给药 实验动物为雄性昆明小鼠，体重18～22 g。给药前小鼠适应性饲养7 d。小鼠按体重随机进行分组，设空白组、对照组、模型组，刺五加组，云芝组，刺五加-云芝不同配比组（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、4:1、3:1、2:1）共14组，每组10只，根据小鼠给药剂量每日早间灌胃一次不同配比组提取液。小鼠给药剂量按人类最大给药剂量乘以9.1进行换算为4.55 mg·kg−1。悬尾实验及强迫游泳实验分为空白组、对照组及各给药组；利血平拮抗实验分为空白组、对照组、模型组及各给药组。在实验过程中，空白组及模型组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃盐酸氟西汀溶液（20 mg·kg−1），连续灌胃14 d。

1.2.2.2 小鼠悬尾实验 灌胃给药第12 d，按照Steru[13−14]的方法，灌胃给药后将小鼠放置于实验室60 min，使小鼠适应实验室环境。实验开始时，将小鼠尾巴尖端2 cm左右悬挂于实验装置上，小鼠与底部有一段距离，使小鼠倒置空中时无所攀抓，经一段时间后小鼠因失望而减少活动，模拟抑郁状态建造小鼠行为绝望模型。实验总用时6 min，并记录小鼠后4 min的悬尾不动时间（小鼠在悬挂处完全停止挣扎或者有微小的肢体颤动）。考察不同给药组对小鼠悬尾不动时间（TST）的影响。

1.2.2.3 小鼠强迫游泳实验 在正式强迫游泳实验24 h前，将小鼠放入实验设备中预游15 min，使小鼠适应环境。灌胃给药第13 d，给药1 h后，将小鼠放置于水温控制在（25.0±1.0）℃的塑料水槽中，水深至鼠四爪不可触底，经历一段时间后，小鼠因放弃而大幅度减少活动幅度以及活动时间，活动之间有长时间的不动间歇为失望行为。实验总用时6 min，记录后4 min的小鼠游泳不动时间[15]。考察不同给药组对小鼠强迫游泳不动时间（FST）的影响。

1.2.2.4 利血平拮抗实验 灌胃给药第14 d，根据Xu等[16−17]的利血平拮抗实验方法，对照组、模型组和给药组均于末次给药后测量小鼠肛温，并于1 h后腹腔注射利血平溶液（4 mg·kg−1）（精确称量1 mg利血平粉末，加10%冰乙酸溶液定容至10 mL容量瓶，配制成0.1 mg·mL−1利血平溶液），空白组同时间腹腔注射等量生理盐水。1 h后观察小鼠上眼睑下垂表现。眼睑下垂有如下四个等级，依此计算分数，眼全闭为4分，眼闭3/4为3分，眼闭1/2为2分，眼闭1/4为1分。2 h后测小鼠肛温，以将体温计探头完全插入小鼠肛门，至少维持2 min[16−17]。

1.2.3 血样及脑的采集与测定 在利血平拮抗实验结束24 h后将小鼠脱颈处死，期间小鼠禁食。实验时眼球取血后断头取小鼠大脑0.2 g置于生理盐水中冰浴匀浆，10000 r/min的条件下离心，离心15 min，取上清液，依照酶联免疫试剂盒说明书采用ELISA法测定血清中IL-10、IL-1β及小鼠脑中神经递质5-HT、NE的含量[18]。

1.3 数据处理

根据多指标综合分析法，整合多个检测指标。评分时小鼠悬尾及强迫游泳实验以对照组为参照，其余实验组以模型组为参照，各指标数据进行标准化处理，即标化值=（给药组−对照组或模型组）/（正常组−对照组或模型组）。

2 结果与讨论

2.1 对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响

结果如表1所示。从结果中可以看出，与空白组比较，不同给药组均能缩短小鼠在悬尾实验及强迫游泳实验中的不动时间。除云芝组、刺五加与云芝比例为1:5、3:1、2:1组外，其余各实验组均P<0.05，均有统计学意义。

从对小鼠悬尾行为影响来看，与空白组相比，刺五加-云芝1:2比例组极显著（P<0.01）降低了不动时间，组间两两比较，1:1和1:2剂量组无显著性差异（P>0.05）。从对小鼠强迫游泳行为影响来看，与空白组相比，1:2比例组极显著降低小鼠不动时间极显著（P<0.01），组间两两比较，1:1和1:2比例组无显著性差异（P>0.05）。实验结果表明，不同配比组均能够明显缩短小鼠不动时间，其中刺五加与云芝比例为1:2时效果最好，其次为1:1。刺五加-云芝1:1和1:2比例组实验效果略次于阳性对照组，但差异不显著（P>0.05）。

表1 不同配比组对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响（n=10, ±s）Table 1 Effects of all groups on immobility time in TST and FST in mice (n=10, ±s)

表1 不同配比组对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响（n=10, ±s）Table 1 Effects of all groups on immobility time in TST and FST in mice (n=10, ±s)

注：同列不同小写字母表示差异显著，P<0.05；表2～表4同。

组别 悬尾不动时间（s） 游泳不动时间（s）阳性对照 72.65±1.23d 57.65±1.23f空白 123.62±9.54a 108.62±9.54a 1:1 88.62±4.18cd 73.28±4.48def 1:2 85.36±7.01cd 69.36±5.80ef 1:3 101.31±1.35bc 85.65±2.52cde 1:4 100.30±6.01bc 85.70±5.35cde 1:5 107.71±5.17ab 95.24±5.03abc 5:1 91.98±11.70bc 77.69±11.74cde 4:1 101.08±12.40bc 85.67±12.58cde 3:1 122.40±20.52a 107.29±20.64ab 2:1 108.54±12.02ab 94.33±13.40abc刺五加 100.18±8.89bc 84.94±8.61cde云芝 108.52±7.54ab 90.10±2.26bcd

表2 对抑郁模型小鼠体温及眼睑下垂的影响（n=10, ±s）Table 2 Effects of body temperature and blepharoptosis in depression model mice (n=10, ±s)

表2 对抑郁模型小鼠体温及眼睑下垂的影响（n=10, ±s）Table 2 Effects of body temperature and blepharoptosis in depression model mice (n=10, ±s)

组别 给药2 h后肛温（℃） 眼睑下垂评分阳性对照 36.7±0.2dbc 1.88±0.83bcd空白 37.5±0.6a 0.00±0.00e模型 35.5±0.4f 3.38±0.52a 1:1 36.7±0.3b 1.63±0.74cd 1:2 36.9±0.3bc 1.50±0.76d 1:3 36.5±0.2bcde 1.63±0.52cd 1:4 36.6±0.2bcde 2.00±0.93bcd 1:5 36.3±0.4cde 1.88±0.83bcd 5:1 36.4±0.5bcde 2.00±0.93bcd 4:1 36.2±0.3de 2.38±0.92bcd 3:1 36.3±0.6cde 2.50±0.76bc 2:1 36.4±0.2cde 1.88±0.83bcd刺五加 36.4±0.3cde 2.00±1.07bcd云芝 36.1±0.4e 2.63±1.06ab

2.2 对小鼠眼睑下垂和体温的影响

结果如表2所示。从结果中可以看出，模型组腹腔注射利血平后，与空白组比较，模型组小鼠体温极显著降低，眼睑下垂评分极显著升高（P<0.01），证明此次造模成功。实验结果表明不同剂量组均能明显降低眼睑下垂评分以及抑制小鼠体温下降，且与模型组比较均有显著性差异（P<0.05，P<0.01），证明具有统计学意义。在抑制小鼠体温下降和眼睑下垂实验结果中，1:2比例组效果最佳。

2.3 对小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影响

结果见表3。与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-10浓度降低，具有极显著性差异（P<0.01）证明造模成功。与模型组相比，除5:1和4:1组外，各剂量组均能不同程度提高小鼠血清中IL-10的含量。各组中刺五加-云芝比例为1:2中IL-10水平最高，1:1组次之，两组组间无显著差异（P>0.05）。与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-1β浓度明显升高，与空白组比较具有极显著性差异（P<0.01）。实验数据表明，刺五加-云芝剂量组1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，能明显降低小鼠血清中IL-1β的含量，且与模型组比较有显著性差异（P<0.05），具有统计学意义。

表3 对小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影响（n=10, ±s）Table 3 Effect of serum IL-10 and IL-1β content in mice (n=10, ±s)

表3 对小鼠血清中IL-10和IL-1β含量的影响（n=10, ±s）Table 3 Effect of serum IL-10 and IL-1β content in mice (n=10, ±s)

组别 IL-10（pg·mL−1） IL-1β（pg·mL−1）阳性对照 711.56±35.56abc 106.72±0.19abc空白 761.56±18.95a 78.87±2.24f模型 567.11±30.87ef 122.29±17.64a 1:1 729.70±37.22ab 83.04±7.60df 1:2 731.93±94.19ab 79.64±17.44f 1:3 704.89±37.47abc 84.79±3.62cde 1:4 653.41±8.98bcd 89.84±16.92bcdf 1:5 666.00±9.62bcd 86.55±5.17cde 5:1 564.52±50.69ef 92.36±5.36abcde 4:1 551.56±4.44f 102.55±4.75bcd 3:1 616.37±7.80def 96.96±5.79abcde 2:1 640.44±36.87cde 98.50±9.88abcd刺五加 606.37±17.96def 109.57±0.33ab云芝 668.22±102.15bcd 100.69±11.69abcd

根据实验数据，小鼠抑郁模型能改变小鼠血清中炎性因子IL-10、IL-1β的含量，使IL-10降低，IL-1β升高。刺五加-云芝配比组能抑制这种效果，且刺五加-云芝比例为1:1、1:2时作用明显。且从两组实验结果来看，刺五加-云芝比例为1:1、1:2时抑制IL-1β的含量升高的作用效果明显优于对照组，两组与阳性对照组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01），具有统计学意义。

表4 对小鼠脑内5-HT和NE含量的影响（n=10, ±s）Table 4 Effect of 5-HT and NE contents in mice brain (n=10, ±s)

表4 对小鼠脑内5-HT和NE含量的影响（n=10, ±s）Table 4 Effect of 5-HT and NE contents in mice brain (n=10, ±s)

组别 5-HT（ng·mL−1） NE（ng·mL−1）阳性对照 299.77±21.13c 6.25±0.40abc空白 308.92±17.31c 5.62±0.64abcd模型 178.40±5.47fg 4.02±0.37e 1:1 371.13±88.59b 6.47±0.9ab 1:2 498.83±6.07a 6.63±0.88a 1:3 252.35±10.66de 5.76±0.41abcd 1:4 164.08±3.66h 5.09±0.46d 1:5 195.54±10.78efg 5.27±0.35cd 5:1 208.45±13.44defg 5.32±0.79cd 4:1 236.15±4.47def 5.55±0.48abcd 3:1 242.02±19.94def 5.36±1.05bcd 2:1 243.90±15.51def 5.43±0.61bcd刺五加 263.15±8.69cd 5.95±0.47abcd云芝 218.08±2.93cdef 4.91±0.67de

2.4 对小鼠脑中5-HT和NE含量的影响

实验结果如表4所示。与空白组相比，模型组小鼠脑中5-HT、NE浓度显著降低，证明模型建立成功。按小鼠脑中5-HT含量结果分析，与其他剂量组相比，刺五加-云芝比例为1:2时作用效果最好，1:1次之，与模型组相比有极显著性差异（P<0.01），且两组治疗效果明显优于对照组及刺五加、云芝单味药组，组间比较具有显著性差异（P<0.05）。按小鼠脑中NE含量结果分析，与其他剂量组相比，刺五加-云芝比例为1:2时作用效果最好，与模型组相比有极显著性差异（P<0.01）。

综合实验结果，在刺五加-云芝不同配比组对小鼠脑中5-HT和NE含量的影响实验中，最佳的配伍比例为1:2，且在对小鼠脑中5-HT影响实验中1:2比例组作用效果明显优于对照组，组间具显著性差异（P<0.05），具有统计学意义。

2.5 抗抑郁作用各检测指标总效应

根据多指标综合分析法，整合多个检测指标。评分时小鼠悬尾及强迫游泳实验以对照组为参照，其余实验组以模型组为参照，各指标数据进行标准化处理，即标化值=（给药组−对照组或模型组）/（空白组−对照组或模型组）。参考专家评分，本研究确定各指标系数为：悬尾及强迫游泳不动时间为2，体温及眼睑下垂评分为1，IL-10和IL-1β为1、5-HT、NE为3。各指标数据的标化值乘以各自权重系数后的加合值即得刺五加-云芝不同配伍比例对于抑郁症模型小鼠治疗作用的总效应值（TE）。实验结果如表5所示，综合各组实验结果证明，各不同配伍比例组1:1、1:2、1:3治疗效果最佳且明显优于刺五加单味药组，其中刺五加-云芝比例为1:2是总效应值（TE）最高，证明其是抗抑郁作用最优配伍。

3 讨论与结论

抑郁症病因复杂，最著名的假说为多种胺代谢障碍假说，其认为5-HT水平的下降，是抑郁症患者和躁狂病人发生的共同基础，5-HT水平的下降只是容易引起情感方面的障碍。抑郁症的发病则需NE功能改变的参与，5-HT参与其中两者相互作用，引起症状。中枢脑内5-HT和NE水平均下降，就会引起抑郁症的发生；另有研究证明抑郁症的发生与机体免疫功能有着密切联系，炎性因子及促炎因子白细胞介素含量的变化能够反应出机体抑郁症的致病程度，通过降低促炎性细胞因子或增强抗炎因子的活性，均能降低IDO过度表达，减少抑郁症状的发生[19−21]。

黄芷熠等[22]将刺五加-山楂按照不同比例配伍，通过行为学实验、利血平拮抗实验观察其提物对抑郁症模型小鼠的影响。将其实验结果与刺五加-云芝抗抑郁能力进行对比后发现，二者均具有良好的抗抑郁作用，本文结果表明，与单独使用刺五加和云芝相比，刺五加-云芝组可使小鼠血清中的IL-10水平和海马中的5-羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NE）水平显著升高（P<0.05），同时IL-1β降低。综合上述实验结果，证明刺五加-云芝配伍使用对各实验指标具有明显的改善作用，刺五加-云芝配伍后抗抑郁作用效果高于单用，同时优于阳性对照组盐酸氟西汀，二者配伍使用后发挥了协同增效的作用，两者最佳配伍比例为1:2。上述研究结果可为抑郁症的临床治疗及抗抑郁药物的筛选、开发和利用提供的新的思路和理论基础。

表5 不同比例配伍的刺五加-云芝标化值和总效应值Table 5 Standardized indexes and total effect values of the investigated Acanthopanax senticosus-Coriolus versicolor