14 个亚洲国家水稻种质资源的苗期耐寒性评价*

赵宗耀，王 尧，逄洪波，金 明，陈 强，李玥莹，杨庆文，郑晓明

(1.沈阳师范大学 生命科学学院，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳师范大学 实验教学中心，辽宁 沈阳 110034；3.中国农业科学院 作物科学研究所，北京 100081)

水稻(Oryza sativaL.)是重要的粮食作物，全世界有一半以上的人口以水稻为主食[1]，其产量对世界粮食安全有着举足轻重的影响。水稻是一种喜温植物，其祖先种为主要生长在热带的普通野生稻(O.rufipgonGriff.)[2-3]。近几十年来，随着气候对自然环境的影响及农业发展状况的改变，水稻种植地向北部温带乃至寒带扩张是其产量和品质的保障需求。在水稻不同发育阶段，低温均会对其发育过程产生影响，如芽期低温影响水稻的发芽率[4]，苗期使叶片发黄、卷曲变形直至植株死亡[5]，开花期使花粉败育[6]以及孕穗期使其结实率降低[7]等。低温使水稻大幅度减产乃至绝收，是限制水稻生产分布的直接因素[8-9]，故研究水稻低温耐受性(耐寒性)的分子机制具有非常重要的理论意义和实用价值[10-12]。

筛选耐寒品种是解决水稻低温伤害最简单、直接和有效的科学方法之一。在丰富的水稻种质资源库中，蕴藏着许多耐寒性强的优良品种，它们也是分子育种优异等位基因的来源[13]。熊建华等[14]利用自然低温条件对中国云南和日本的30 个水稻品种的耐寒性进行了鉴定，共筛选出18 个不同熟期的耐寒性品种；王兰等[15]从84 个水稻核心种质中初步筛选了13 个苗期耐寒材料，其中粳87-304 属于一级耐寒品种；周新桥等[16]以广东种质资源库和南方稻区的150 个品种为研究对象，最终筛选出了3 个苗期耐寒性品种；丁国华等[17]于2017 年黑龙江省发生的“倒春寒”时期，在大田试验条件下从888 个材料中筛选鉴定出130 个苗期极耐冷水稻材料。在这些研究中，有些是针对某一地区的地方品种和育成品种，有些只研究水稻的某一个亚种，缺乏对整个物种和分布区水稻品种耐寒性的整体了解。

本研究以14 个亚洲国家的187 个水稻核心种质资源作为试验材料，以秧苗黄叶率为评价指标，对这些水稻品种的苗期耐寒性进行鉴定，筛选不同遗传背景下耐寒性较强的水稻品种，为抗寒种质资源的鉴定以及遗传改良提供参考，同时也为进一步的全基因组关联分析(GWAS)的试验条件打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究收集包括中国24 个省市区及其他13 个亚洲国家的187 个水稻核心种质资源为材料，其中籼稻125 个，粳稻62 个(表1)，覆盖中国、南亚和东南亚等水稻品种。种子均为当年采集。试验开始前将种子放入培养箱50 ℃烘干72 h，打破种子休眠。

表1 试验材料详细信息Tab.1 Detail information for the materials

表1(续)

1.2 试验方法

1.2.1 材料种植

每个水稻品种选取30 粒种子，要求种子颗粒饱满、未遭到机械损伤、霉变和虫害等，以保证良好的发芽率。种植前对营养土进行高压灭菌，以减少水稻幼苗感染霉菌的概率。营养土和蛭石以8∶1 (V∶V) 混合，保证土的透气性。30 粒种子均分为2 份，1 份为处理组，另1 份为对照组。播种之前将土装入花盆中浸水12 h，用镊子小心将种子放到花盆表面，密度适中，盖约1 cm 厚的土，插上标牌，做好记录。将育苗盆放入组培室中进行培养(温度30 ℃，12 h 光照/12 h黑暗)。

1.2.2 低温处理

参考前人关于水稻幼苗期耐寒处理的研究[10-11,18]，本试验选取水稻黄叶率作为苗期耐寒指标，以三叶期幼苗(自播种起之后的第14 天)作为试验材料，进行低温4 ℃胁迫。根据水稻的亚种分类和地理位置等信息将其分成4 组，各处理组处理时间分别是24、36、48 和60 h，以确保每组水稻品种的平行性。试验重复3 次。计算黄叶率：黄叶率=黄叶数/总叶数×100%，植株全部死亡的黄叶率记为100%。

1.2.3 耐寒性评价及等级分布图绘制

在低温处理后再经过7 d 缓苗期，对水稻幼苗进行耐寒性评价[10,18]。根据处理组与对照组相比的黄叶率将水稻分为5 个等级：黄叶率＜5%，0 级；5%≤黄叶率＜25%，1 级；25%≤黄叶率＜50%，3 级；50%≤黄叶率＜75%，5 级；黄叶率≥75%，7 级。统计各处理组每个耐寒等级的品种数量，利用Excel 2013 绘制每个处理组各耐寒等级分布图。

1.2.4 水稻苗期表型丰富度的计算

在水稻群体水平上对苗期耐寒表型进行GWAS 关联分析时，表型丰富度与关联分析结果准确性成正相关[19]，故本研究进行表型丰富度的测定。表型丰富度借用生态学中物种丰富度的概念，将每个处理组作为1 个群体，以耐寒等级的数量(S)、全部品种的个体数(N)及每个耐寒等级中的个体数(Ni)来综合表示多样性。本研究采用遗传学中的表型丰富度Hill 多样性指标[20]进行计算：，可以准确得出表型丰富度最高的处理组，进而为下一步的GWAS 分析打下基础。

1.2.5 亚种间耐寒性差别分析

统计各处理组粳、籼2 个亚种的黄叶率及其品种数量，分别使用R 语言和Excel 2013 进行箱线图和柱状图的绘制，分析亚种间耐寒性的差异。

1.2.6 耐寒性品种的地理分布

水稻是具有一定群体遗传结构和地理分布的作物，其遗传距离和地理距离正相关[21-22]。本试验根据种植区域对样本进行分组。在同一区域内，各品种对当地生态环境的适应性较类似，故对这些品种进行了不同时长的处理，以便得到更多的耐寒信息。同时，为了推测水稻品种耐寒性与地理位置的相关性，利用R 语言绘制了全部水稻品种耐寒性的地理分布图。由于各品种是在不同处理时间梯度进行的耐寒等级鉴定，故通过处理时长系数(60 h 与其他3 组处理时间的比值)对其他3 组中每个品种的黄叶率进行重新估算(即：原黄叶率×系数)，进而统一所有品种的耐寒等级。

1.3 数据统计分析

每个品种的黄叶率均重复测定3 次，取其平均值进行耐寒等级鉴定和各指标的计算。图形的绘制采用Excel 2013 和R 语言进行，并用Adobe Illustrator CS6 软件对矢量图进行编辑。

2 结果与分析

2.1 低温处理后各耐寒等级的形态学变化

全部水稻品种在低温胁迫后均出现株高变矮现象，说明其生长发育受阻，但各个品种受到的抑制程度均不相同。由图1 可知：0 级强耐寒品种经低温胁迫后，处理组与对照组相比株型明显变矮，但叶片上仅表现为少量叶尖发黄；1 级较耐寒和3 级中耐寒品种除了表现为株高变矮外，叶片也出现了不同程度的卷曲、变脆及发黄现象，且这2 个级别品种的黄叶率与0 级相比差异较大，1 级较耐寒品种的黄叶率最高达到了25%，而3 级中耐寒品种的黄叶率更为严重，在≥25%～50% 之间；5 级中敏感和7 级敏感品种中，植株不仅出现严重的叶片黄化问题，一些植株还出现不同程度的死亡，乃至所有植株全部死亡。

图1 4 ℃处理不同时间后水稻品种的形态变化Fig.1 Performance of rice cultivars under different treatment time in 4 ℃

2.2 水稻品种低温处理后各处理组的耐寒等级分布及表型丰富度

由图2 可知：随着低温处理时间的延长，死亡的水稻品种逐渐增多。由24 h 处理组的14 个品种逐渐增至36 h 处理组的18 个品种(占观测品种数的35%)，48 h 处理组有28 个品种死亡(占观测品种数的65%)，而60 h 处理组死亡品种高达40 个(占观测品种数的85%)。每个低温处理组内部的耐寒等级所占的百分比也各不相同。24 h 组内0～7 级耐寒品种所占的比例分别是9%、20%、21%、20% 和30%，而36 h 组中各耐寒等级由强到弱的百分比则为18%、21%、16%、10% 和35%。随着处理时间的增加，48和60 h 处理组中品种的耐寒等级分布发生了明显变化，表现为0、1 和3 级的耐寒品种逐渐减少；7 级低温敏感品种显著增多，占所有观测样品数的比例均超过50%。4 个低温处理时长的表型多样性指标分别是4.77、4.56、2.25 和1.37，说明随着低温处理时间的延长，品种间的表型丰富度逐渐降低。

图2 187 个水稻品种在不同处理时间的耐寒等级情况Fig.2 The cold tolerance level distribution of 187 rice cultivars in different treatment time

2.3 籼稻和粳稻2 个亚种的耐寒性差异

由图3a 可知：在不同的处理时间内，均是籼稻的黄叶率明显高于粳稻，且随着处理时长的增加，籼稻的黄叶率逐渐升高，黄叶率中位线从24 h 的67.5%增加到60 h 的100%。粳稻的耐寒性较强，黄叶率的中位线由24 h 的30%、36 h的7.5% 和48 h 的10% 增加至60 h 的70%。由图3b 可知：0 级强耐寒品种总计有21 个，仅有2 个为籼稻，其余均为粳稻，耐寒品种中粳稻百分比达到了91%；1 级较耐寒品种有24 个，而籼稻只有7 个，其余均为粳稻，耐寒品种中粳稻百分比达到了71%。

图3 粳稻和籼稻的耐寒性差异Fig.3 The difference of cold tolerance between O.sativa ssp.japonica and O.sativa ssp.indica

2.4 品种耐寒性与地理分布的关系

研究进一步筛选出11 个耐寒品种，分别是印度尼西亚籼稻品种Sepah (126345)、韩国粳稻品种eo 和Chalbyeo (15020 和125698)、马来西亚粳稻品种Ers468396 和Puthi (125877 和126231)、日本粳稻品种Kotobuki Mochi (117518)、不丹粳稻品种Dagpa Mras (127043)以及中国河北省粳稻品种水原300 粒(02-00294)、云南省粳稻品种毫巴永1 (21-01853)、浙江省粳稻品种Wutounuo 和秀水115 (204 和ZD-01559)。

由图4 可知：11 个0 级耐寒品种中仅有1 个是籼稻，属于48 h 处理组的印度尼西亚品种。10 个粳稻品种分别来自5 个国家，中国最多有4 个，韩国和马来西亚各2 个，日本和不丹各1 个。中国的4 个品种中，2 个品种分布于浙江省，云南省和河北省各1 个。经黄叶率校正后的1 级较耐寒品种总计21 个，主要分布于中国的东北部以及韩国、日本一带，在中国西南边陲(如云南省和贵州省)以及菲律宾、尼泊尔等国也有零星分布。

图4 187 个品种综合耐寒等级的地理分布示意图Fig.4 Geographic distribution of 187 cultivars of complex cold tolerance

3 讨论

水稻是冷敏感作物，中国每年因低温造成的水稻减产高达500 万t，占水稻总产量的2.5%[11]。因此，开展水稻种质资源耐寒性的精准鉴定和评价是培育耐寒水稻品种的重要前提。

水稻秧苗素质对物质转化和分配有重要影响，苗期耐寒性强弱直接决定水稻产量。研究人员已经对水稻苗期耐寒鉴定评价开展了大量工作[13-18]，主要分为田间和实验室两大类。田间具有大批量鉴定的优势，但同时受气候和环境变化的直接影响，具有不稳定性和难重复等弊端；实验室内人工气候培养箱可以精确调控低温胁迫的温度和时间，具有实验条件稳定和可重复性好等优势。水稻耐寒性属于多基因位点决定的数量性状，受环境因素等多方面影响[4-6]，故本研究采用室内人工气候培养箱方法作为水稻苗期低温鉴定条件。为了更接近于水稻在实际生产中的种植方式，本研究均采用8 cm×8 cm×10 cm 型号的黑色塑料花盆盆栽，营养土与蛭石以8∶1 的体积比混匀，土质统一。

低温影响水稻生长发育，引发一系列生理生化变化，光合、电导率、活性氧和丙二醛、可溶性糖含量、冷胁迫诱导相关氨基酸及抗氧化酶等相关生理生化指标均可以作为水稻苗期耐寒鉴定指标[23-24]，但耗时费力，对于大规模鉴定群体种质资源耐寒性具有一定的局限性。而形态学指标简单易行。诸多学者对以自然低温或者气候培养箱低温处理不同时间后的黄叶率作为衡量水稻苗期耐寒等级的评价标准[15,18]，证实黄叶率是研究水稻苗期耐寒的可靠指标。因此，本研究以水稻苗期黄叶率为评价指标，在4 ℃条件下对187 个水稻品种进行24～60 h 低温胁迫，摸索最适合的低温处理时间。结果显示：随着低温处理时间的延长，植株的营养生长受损逐渐加重，死亡的品种数大幅升高，到60 h 后，除了极耐寒品种外，绝大部分水稻品种已经接近全部死亡。全基因组关联分析(GWAS)是基于连锁不平衡原理，通过分子标记和性状表型进行相关性分析，以鉴定与目标性状紧密相连的位点或者候选基因，目前已广泛应用于作物的农艺性状的遗传解析中[21,25]。本研究中，24 和36 h 处理组中形态性状的多样性是其他处理组的2 倍以上，说明此条件更适于进一步的GWAS 分析。

亚洲栽培稻分为籼稻和粳稻。籼稻主要种植于热带和亚热带低纬度地区，而粳稻在长期的人工驯化及适应性进化过程中具备了耐寒特性，种植在高纬度和高海拔等温度较低的环境[26]。研究表明：水稻最初向寒冷地区扩张可能与某些耐冷基因有关，促进了其对低温的适应性[10-12,27]。MA等[10]发现：COLD1第四外显子的变异在粳稻驯化过程的向北扩张中起重要作用，生长在温带的粳稻在驯化过程中，人工选择保留了CTB4a基因的野生稻单倍型；进一步研究发现：亲本启动子变异是引起耐冷性差异的根本原因，单倍型分析发现耐冷单倍型Tej-Hap-KMXBG 是温带粳稻在低温环境驯化产生的。LIU 等[27-28]利用641 个水稻和野生稻群体确定bZIP73的表达量升高能提高水稻幼苗和生育期的耐寒能力，且该基因的等位变异和籼稻与粳稻的分化相关。MAO 等[12]的研究显示：基因HAN1的启动子中获得了1 个MYB顺式作用元件，增强了温带粳稻的抗寒性，使其能够适应温带气候。本研究表明：耐寒性较好的品种主要分布于中国的东北部及日本，而低温敏感材料则分布于印度、菲律宾、越南和泰国等东南亚国家及中国的长江以南地区，也说明水稻品种的耐寒性与其地理分布密切相关。温带地区水稻品种的耐寒性较强，而热带、亚热带地区的品种耐寒性较差，可能与其适应当地的气候条件和种植策略有关。各处理组筛选的21 个0 级强耐寒品种中，只有2 个是籼稻品种；同时7 级低温敏感品种中，高达88%是籼稻，均说明粳稻比籼稻具有更好的耐寒性，这也与以往的研究结果[11-12]相一致。本研究中筛选出的2 个强耐寒籼稻品种分别是云南地方传统品种鸡血糯21-03781 和印度尼西亚品种126345。云南省是独特的高原气候，为了增加水稻产量，常会选择种植苗期耐寒性较强的早籼稻，说明水稻的耐寒性不仅与其所处的地理位置有关，也与当地的种植策略密切相关。而印度尼西亚虽然地跨赤道，但是属于海洋间多个岛屿组成的群岛国家，也存在高山高海拔地区，而伴随着海拔的逐步升高，气温逐渐下降，故不同品种的耐寒性差异虽然与其遗传背景相关，但是其所处的具体地理位置也对品种耐寒性有着一定程度的影响。因此，本研究中鉴定的1 级耐寒的籼稻和低纬度地区的品种也可作为耐寒品种，可为籼稻和低纬度地区的水稻育种提供资源和信息。

4 结论

本研究以14 个亚洲国家的187 个水稻品种资源作为研究对象，黄叶率作为鉴定指标，鉴定了其苗期耐寒等级，筛选到11 个强耐寒的水稻品种，包括10 个粳稻品种和1 个籼稻品种，得出了粳稻的耐寒性普遍强于籼稻的结论。同时，也发现品种的耐寒性除了取决于自身的遗传信息外，还与其具体的地理分布及当地的种植策略等密切相关。本研究发现：4 ℃低温处理下可用于全基因组关联分析的最适条件为24 h 或36 h。研究结果对于水稻耐寒种质资源的评价及分子育种均具有重要的理论和现实意义。