急性心肌缺血模型大鼠内关、心俞穴穴区肥大细胞的分布及特征*

邓雅方，胡 颖，许金森，万 隆，罗 来，董亚琴△

（1.福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350108；2.福建省中医药科学院，福建 福州 350003）

穴位不仅仅是神经血管等结构的复合体，在这个角度并未找到确切的穴位特性依据。从功能性、动态性的穴位敏化角度探讨穴位实质，是近年研究者们寻求的新出路，也带来了新的进展和认识。其中要注意的是肥大细胞（mast cell，MC）活化的动态表现与穴位敏化密切相关，MC是穴位敏化的重要物质基础，进一步研究疾病状态下病理靶器官相关穴区MC的改变，对腧穴本质研究仍有重要意义。临床上治疗冠心病选穴重用心俞穴和内关穴[1-2]，本实验通过观察急性心肌缺血模型大鼠心俞穴和内关穴穴区MC的改变，为进一步证实MC分布及结构改变是腧穴敏化重要物质基础和客观指标提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康SPF级SD雄性大鼠12只，体质量（220±20）g，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验前7 d适应性喂养委托福建省中医药科学院动物实验中心完成，环境自然光照、温度26℃、湿度50%～60%，饮食自由。12只SD大鼠按随机数字表法分成对照组和模型组，每组6只。

1.2 主要仪器与试剂 ISO（Sigma-Aldrich，USA，批号：WXBC9656V）；HE染液套装（索莱宝科技有限公司，北京，G1003）；TTC（Sigma-Aldrich，USA，批号BCBX0337）；JB-P5型石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；LEICA RM2016切片机；Powerlab多通道生理记录仪（澳大利亚AD Instruments公司）；小动物麻醉呼吸系统（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 模型制备 模型组于大鼠四肢内侧根部及背部皮下多点位注射ISO 60 mg/kg，注射2次，中间间隔24 h。大鼠吸入异氟烷进入稳定麻醉状态后，连接Powerlab多通道数据采集分析系统，将心电图（ECG）3个针状电极插入大鼠右上肢、左右下肢皮下，记录肢体Ⅱ导联ECG，稳定3～5 min后根据ECG评判是否造模成功。造模成功的评判标准：T波倒置或双向，并伴有ST段抬高[3]。对照组皮下多点位注射生理盐水60 mg/kg。

1.4 TTC染色测定心肌缺血面积 造模完成后，每组随机抽取3只大鼠，经麻醉后立即开胸取出心脏，置于-20℃冰箱冷冻3 h，从心尖向心底的方向将心脏横向切成6片（每片约厚1.5～2 mm）。放入2%TTC溶液中，37℃恒温箱避光水浴30 min，每隔5 min进行一次翻面。用4%多聚甲醛冲洗掉多余TTC染液后固定。成功染色正常心肌组织呈红色，缺血组织呈苍白色。图像扫描后通过Image-Pro Plus 5.1图像分析软件计算心肌缺血面积。心肌缺血面积比=缺血面积/总面积×100%。

1.5 甲苯胺蓝染色法检测MC 所有大鼠麻醉状态下处死，剪取左侧心俞穴和内关穴5 mm×5 mm×5 mm组织（皮肤及皮下肌肉），甲醛固定组织后包埋切片处理，切片脱蜡水化后浸入0.5%甲苯胺蓝进行染色，冲洗、透明后组织封固。

1.6 MC图像采集和数据分析 利用正置光学显微镜拍摄甲苯胺蓝染色切片图像（拍摄倍数为10×）。于CaseViewer软件中放大40倍后通过五点取样法，每个样本切片随机选取10个等大不重叠视野，单个视野大小为469 μm×893 μm。统计平均单视野MC和脱颗粒MC的数目，计算样本MC脱颗粒率，MC脱颗粒率=脱颗粒MC数目/MC总数目×100%。

1.7 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，以均数±标准差（±s）表示，进行两独立样本t检验和配对样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TTC染色结果 TTC染色后正常心肌组织呈现红色，缺血组织被染为苍白色。染色结果显示与对照组相比，模型组白色区域面积增大，主要集中在心尖部，提示模型组大鼠心肌组织出现损伤。见图1。

图1 大鼠心肌组织TTC染色

2.2 两组大鼠心肌缺血面积比较 与对照组相比，模型组心肌缺血百分比显著上升，提示60 mg/kg ISO可造成心肌组织一定程度损伤。见图2。

图2 心肌缺血面积比统计图

2.3 甲苯胺蓝染色结果 染色结果显示，对照组大鼠心俞穴、内关穴穴区MC多呈椭圆形，边界完整清晰，周边无颗粒样物质。急性心肌缺血模型大鼠穴区MC数目明显增多，MC呈现破裂、多角、星云等形状，周围散落分布大量颗粒样物质。见图3。

图3 MC甲苯胺蓝染色（×400）

2.4 急性心肌缺血各穴区MC活化情况比较 急性心肌缺血造模完成后，与对照组相比，左侧心俞穴MC数目和脱颗粒率显著上升，左侧内关穴MC脱颗粒率显著提高，提示脏腑有疾时，疾病相关穴位MC活化表达显著。对照组内比较，左侧内关穴MC数目显著高于左侧心俞穴，提示正常状态不同部位穴位MC数目存在差异表达，见表1。

表1 各穴区MC活化比较（±s，n=6）

表1 各穴区MC活化比较（±s，n=6）

注：与（左）心俞穴相比，aP＜0.05；与对照组相比，bP＜0.05。

（左）心俞穴 （左）内关穴M C脱颗粒率/%对照组 1 2.0 0±2.1 9 3 1.5 9±4.6 7 2 1.0 0±6.5 3 a 3 0.4 3±4.6 9组别M C数目（个/视野）M C脱颗粒率/%M C数目（个/视野）模型组 1 8.9 5±5.0 0 b 4 2.8 4±4.3 5 b 2 2.7 5±5.1 9 4 4.7 9±8.3 6 b

3 讨论

穴位是体现脏腑阴阳气血失衡和调节失衡的部位，脏腑阴阳失衡经络腧穴可能出现疼痛、皮肤样改变等反应[4]。1977年首次以大数据的方式观察到经络敏感者循经线上出现出血点、皮疹带、白线等[5]，同时内脏（包括皮肤等器官组织）病变引起相应神经节段腧穴体表牵涉痛也是“有诸内者，必形诸外”的体现，可称之为“穴位敏化”[6-7]。如研究者发现肺脏、肠道、生殖有疾时，相应神经节段体表出现压痛，区域与论治腧穴有关[8-10]，穴位不是固定不变的结构，脏腑生理病理状态的改变，穴位敏化呈现“”敏化与“失敏”的状态切换。

伊文思蓝（EB）渗出点是出现在体表内脏损伤导致的神经源性炎性反应敏化部位，内脏病理变化通过中枢、周围等机制，引起病理损伤器官相应神经节段体表出现神经源性炎性反应，局部炎性因子释放、血管扩张。课题组前期研究发现[11]，大鼠肾上腺素急性心肌缺血模型造模后4 h，生理盐水对照组心俞穴几乎未见EB渗出，而模型组心俞穴EB渗出率高达60.46%。其他研究者发现大鼠冠脉结扎造成心肌缺血模型后6 h，EB渗出点多分布在左侧胸、背、肩、上肢部位，渗出点区域呈现痛觉敏化，并且与心绞痛患者牵涉痛分布部位出现相似情况[12]。

穴位敏化是出现在内脏损伤相应神经节段体表的神经源性炎性反应，是内脏损伤引起的相应体表区域特殊的感觉阈值变化，使得穴位对压痛、温度、光、电、声、化学等刺激的激活阈值下调[7]，表现形式多样[13]，引起穴区炎性介质的释放有所不同，但MC活化是穴位敏化的共同环节，MC分布及结构的活化表达是穴位敏化的重要物质基础。内脏损害可导致脊髓及脊髓上中枢躯体内脏会聚神经元敏感性增强，从而增强体表刺激信号传入，外周机制通过背根反射、轴突反射传递至外周，引起MC释放相关炎性因子，进而产生穴位敏化[14-15]。

研究者们发现不同病理情况，可引起相关穴区MC改变。膝骨关节炎模型兔犊鼻穴穴区MC数目显著增多[16-17]，MC脱颗粒率释放致痛物质[17]；胃溃疡模型大鼠足三里穴、中脘穴、胃俞穴穴区MC活化显著，呈现MC募集和脱颗粒现象[18]；李志刚课题组发现[19-21]，膝骨关节炎大鼠阳陵泉、鹤顶穴穴区MC数目及脱颗粒率均明显高于正常组大鼠，且活化程度与病程相关。笔者课题组前期研究也证实[22]，哮喘大鼠肺俞穴、华盖穴、定喘穴穴区MC数目及脱颗粒率显著上升。本实验结果显示大鼠急性心肌缺血损伤，可致左侧心俞穴、左侧内关穴穴区MC数目增加和促MC脱颗粒，与前述研究结果一致，进一步证实MC分布和结构的改变是发生穴位敏化物质基础。

MC广泛存在于人体各部位，分布于皮肤、结缔组织、以及呼吸道、肠道等器官黏膜中，常见于血管、神经末梢附近[23]。穴位解剖层次包括表皮、真皮、皮下、筋膜，主要为结缔组织，是血管、淋巴管、神经丛的复合体[24]，穴位结缔组织多存在MC，并沿血管神经分布。这为证明MC是穴位敏化重要结构物质提供解剖基础。同时李永明教授量化不同部位皮肤肥大细胞后发现皮肤肥大细胞分布规律和经典穴位以及微针刺系统呈现高度一致[25]。MC有经穴分布倾向，但生理状态下不同部位腧穴MC含量不同，本实验发现正常大鼠位于四肢部的内关穴MC数目高于背部心俞穴MC数目，提示生理情况下四肢腧穴较背部腧穴MC含量更高。研究中也发现足三里、三阴交、内关、曲池穴区皮肤MC含量显著高于肝俞、胃俞穴区MC[11]，这与本实验结果一致。