弓形虫病诊断技术在基层兽医实验室的应用

欧阳志良 黄添祥 温 蕾

广东省东莞市厚街镇农业技术服务中心 广东 东莞 523960

弓形虫是一种细胞内寄生虫,主要生活在细胞内,并能随着血液流动向全身各处,所以可能威胁到全身各个器官系统。其生长阶段要求两个宿主,中间宿主有鱼、鸟、昆虫等,十分广泛,终宿主则是猫科动物。因为这一点,其可以在世界范围内流行,引发人兽共患病。如果感染的是孕妇,基本有一半的几率可以垂直感染给胎儿,其余可能出现流产、死胎、畸形等。如果是感染的宠物,可能导致怀孕宠物流产、死亡。在畜牧方面,本病也会带来繁殖困难、大量死亡等情况。近年来,伴随着宠物饲养的流行,人类通过接触宠物感染弓形虫病的比例日益增加。因此,各相关实验室积极选择快速有效的方法对本病进行检测,并随着感染频率的增加,要求推广更加灵敏高效的检测手段。目前对本病的诊断方法有如下几种：

1 染色试验(DT)

该方法曾专门用于本病病原检测,特异性、灵敏度和可重复性都比较强。但缺陷在于该方法必须使用活的、可感染的速殖子进行检测,而这带来极大的危险,所以只能在生物安全水平高的实验室应用。目前,这一技术得到改良,将弓形虫虫体用甲醛固定在玻片上作为抗原,孵育待测血清,之后使用特殊的添加物,可以在虫体周围展示出淡黄色,列为阳性。这样一来操作简单,快速,而且特异性强,所以适用于进行现场筛查。

2 凝集试验

该方法有直接凝集(DAT)、间接凝集(IHA)和间接荧光抗体试验(IFAT)三种。就该方法而言,操作简单、结果出的快,敏感性、特异性和重复性也都良好。以三种不同方式对比来讲,阳性反应出现时间DAT比IHA快,所以更容易检测出早期感染的IgG抗体。而IFAT在灵敏度和特异性方面更具优势,但也有更高的成本,同时不适合存在类风湿因子干扰的个体检测。

3 免疫胶体金技术

该技术利用抗原抗体相结合的原理,用胶体金探针标记相应的抗原或抗体,进而放大信号,然后借助光镜、目测、显影等方法给出诊断结果。大体分为免疫金银染色法、快速斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析法(GICA)。其中GICA是近年来应用普遍且发展迅速的新技术之一,将蛋白抗体、新型材料、层析技术和胶体金等相结合,表现出成本低,操作简单,试剂盒种类繁多,检测对象范围广等优势,所以多用于动物实验室开展现场筛查。

4 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA也是当前应用很广泛的技术,操作相对简便,结果准确,仅次于PCR技术。对于本病的检测,有常规和间接ELISA法、葡萄球菌A蛋白ELISA(SPA-ELISA)、更高特异性的DOT(斑点)-ELISA、亲和素-生物素-ELISA和PCR-ELISA。其中PCR-ELISA的敏感性、特异性都较强,也比较稳定。其PCR产物经过标记后与特异性探针杂交,再通过相关酶显色反应,可通过酶标仪检测OD值,判断感染情况。该方法的检测阈值是20fg左右的弓形虫DNA,灵敏度很高,不易发生交叉反应,重复性好[1]。随着分子生物学发展、荧光PCR技术的应用推广,对于本病的诊断在基层动物实验室有了更好的选择。

5 荧光定量PCR技术

常规的PCR技术,操作中容易造成污染、而且对弓形虫感染者不同时期感染程度的量值变化情况无法掌握。该方法增加了荧光探针杂交,实现了DNA实时定量；在封闭状态下进行检测,它的特异性和准确性都优于其它技术,不容易交叉污染,因此成为了当今实验室弓形虫诊断和研究非常重要的手段之一。2019年,李双星等[2]基于新一代Taqman-MGB探针技术,从该方法进行延伸,给出可以实时检测的技术形式,特异性和敏感性更强,为本病的临床病原检测等方面提供技术支撑,为未来犬弓形虫亚单位疫苗的效果评价也提供了理论基础。由于分子生物学检测方法对实验室要求高,且诊断试剂价格较贵,不适用于在基层兽医实验室和动物医院实验室推广。

展望

近几年通过大量的试验研究,在弓形虫病诊断方面取得很大的进展,这有助于本病防控工作的开展,良好控制了本病的扩散。但对本病的诊断仍然存在以下问题：现场快速检测的商品化试剂盒不多；单一诊断不准或成本高；诊断的抗原或抗体纯度不够高、制备难、成本高；大多数精确的诊断技术对实验室要求高,用于实验室研究更合适,基层应用仍然不广。基于对解决这些问题的考虑,在医学技术和检测技术逐步发展的背景下,积极建立综合检测系统,用以弥补单一诊断方法的不足、更多的用于基层兽医实验室和动物医院实验室的推广,是接下来值得探讨的问题。对此需要相关工作人员加强对本病免疫学诊断方法的研究和总结,立足于当前方法的缺陷和限制,进行改进和优化,提出更有效的检测技术。