三七联合丙泊酚治疗外伤性脑损伤疗效及机制的研究

王利梅，杨骐睿，李成，王金伟，吴春妍，王琼仙

（1 昆明医科大学实验动物学部，云南 昆明；2 云南省骨科医院，云南 昆明；3 昆明医科大学公卫学院，云南 昆明；4 昆明医科大学药学院；云南 昆明)

0 引言

脑是中枢神经系统的重要组成部分, 是人类意识、思维、心理活动的中心, 一旦由于缺氧、出血、梗死、变性疾病等原因造成大量神经元缺失时,导致外伤性脑损伤（traumatic brain injuries，TBI）因不能产生新的神经元而致中枢神经系统损伤后的功能难以恢复。找到合理的脑损伤治疗方案尤为重要。

脑源性神经营养因子( brain derived neurotrophic factor ,BDNF) 是在脑内合成的一种蛋白质，是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需的。

丙泊酚是目前临床上普遍用于麻醉诱导、麻醉维持、ICU 危重病人镇静的一种新型快速、短效静脉麻醉药。因此丙泊酚对脑组织的作用已得到越来越多的关注，许多学者提出丙泊酚对损伤脑组织存在保护作用[1-3]。

三七为五加科多年生草本植物，临床主要用于治疗心脑血管疾病及跌打损伤等。近年来三七总皂苷对神经系统的保护作用尤引人关注，许多学者已证明其对脑神经细胞的损伤具有保护作用[4]。

基于此，本项目是在复习大量文献基础上拟调查三七联合丙泊酚对脑的治疗效果，是否是通过上调BDNF 及其受体TrkB 和下游信号分子来实现的。

1 材料与方法

1.1 动物的分组

140只成年SD 大鼠，雌雄各半，体重200±20g，随机分为四大组。正常组(假手术组，A 组），TBI 组(脑损伤组，B 组），TBI+丙泊酚组(丙泊酚治疗脑损伤组，C 组），TBI+丙泊酚+三七组(三七联合丙泊酚治疗脑损伤组，D 组）。实验动物购于昆明医科大学实验动物学部，实验动物质量合格证号：SYSK( 滇)2005-0004，许可证号SCXK( 滇)2011-0004。

1.2 动物模型建立与药物治疗

采用改良的Feeney 氏 法自由落体撞击制作脑外伤模型。用3.6%水合氯醛(1ml/100g)进行腹腔注射麻醉。麻醉完全后,将大鼠俯卧位固定，常规消毒铺巾,在头距前囟5mm 处冠状切开皮肤成“V”或“U”型切口,将头皮向尾侧翻开。分离骨膜,暴露右侧顶骨,于矢状缝旁开2.5mm,冠状缝后1.5mm 钻一骨孔,咬除颅骨直至骨窗扩大为直径5.0mm×5.0mm,显露硬脑膜，注意保护矢状窦和硬脑膜。将洁净的垫片轻轻地置于骨窗中央，以50g 重的铁质圆柱体自30cm 高处沿铁杆自由落体撞击垫片,造成右侧大脑运动皮质区挫裂伤。假手术仅咬除颅骨，不进行砸伤，饲养护理同手术组。术后前3型每日给脑外伤大鼠腹腔注射头孢8万单位预防感染，术后2 周内每日早晨8 点给予药物治疗，剂量及给药方式如下： 丙泊酚20mg/kg，腹腔注射。三七 10mg/d[5]。

1.3 行为学评价

1.3.1 大鼠的神经功能缺损评分（neurological severity score,NSS）

分别于损伤后1d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d、12d 和13d 进行神经功能双盲法评分，三个经过培训熟练掌握评分标准的人进行评分，取平均值进行统计学评分，每天评分时间固定在早上8 点。

1.3.2 电生理CSEP 皮层体感诱发电位检测

将大鼠头部固定于脑立体定位仪平台,剪去颅顶毛,在前囱部位沿中线切开皮肤1.5cm,钝性分离,充分暴露颅骨,清楚地暴露颅骨骨缝,在冠状缝后缘1-2mm、矢状缝旁开2-3mm,手持电钻,用2.5mm 球形牙科钻缓缓钻磨颅骨(要求钻头轴心倾斜与颅骨面成30°夹角),要求恰好钻到出现白色的、略带透明的骨皮质,然后用眼科镊轻轻挑起残余的骨皮质,并小心剥离,即可暴露出完好的硬脑膜。然后将银球引导电极用万向夹固定于钻孔处,相当于皮层感觉运动区(额顶区)，随后将2个注射针头分别插入大鼠对侧前爪腕部的两侧皮肤,刺激输出的2个电极(注意2个电极不能相触)分别连接2个注射针头,开始刺激并观察诱发电位的变化。

1.4 样本获取

NSS 评分及电生理检测结束后，开始灌注固定取材，用于形态学研究；每组15只。材料放入4%多甲固定过夜，其他动物模型，分别治疗后3d、14d，进行新鲜样本取材；首先每个时间点10只/组，获得脑组织，入-80℃冰箱备用。

1.5 统计学分析

2 结果

1d ： Sham 组，NSS 评分为0分，表明没有受到损伤。TBI 组Sham 组比较，P=0.000 ＜0.01，有显著性统计学差异；丙泊酚治疗组与TBI 组比较，P= 0.000 ＜0.01，有显著性统计学差异；三七治疗组与TBI 组比较，P＞0.05 无统计学差异；说明三七治疗需要一个累积效应，只有在一定的时间，达到一定的血药浓度，才能发挥其作用。

3d 直到13d：Sham 组，NSS 评分为0分，表明没有受到损伤。TBI 组与Sham 组比较，损伤依次分别逐渐加重，P=0.000 ＜0.01，有显著性统计学差异；丙泊酚+TBI 治疗组与TBI 组比较，损伤逐渐加重，P=0.000 ＜0.01，有显著性统计学差异；三七+丙泊酚+TBI 治疗组与丙泊酚+TBI组比较，用了三七以后随着三七累积数量的增加，损伤依次分别逐渐减轻，P=0.000 ＜0.01，有统计学差异；说明三七治疗TBI 有显著的疗效。

见图1。

图1 各组间每日所得神经损伤程度评分

通过分析得出，三七治疗需要一个累积效应，只有在一定的时间，达到一定的血药浓度，才能发挥其作用。其治疗TBI 有显著的疗效。

3 讨论

本实验通过建立TBI 大鼠模型，用三七联合丙泊酚治疗后与治疗前比较，通过行为学评价（NSS 评分和电生理CSEP 皮层体感诱发电位检测）结果显示：三七+丙泊酚+TBI 治疗后与治疗前比较，NSS 评分我们发现单纯丙泊酚组，三七联合丙泊酚组对TBI 损伤都有治疗作用，但通过比较发现联合用药组展现出更好的治疗效果；而CSEP电生理检测结果我们可以看出，TBI 损伤后的确对大鼠的神经传导功能造成了抑制性的作用，经过治疗后发现联合用药组能够更好地让神经传导功能有一个好的恢复作用，可能是由于在治疗过程中三七通过其活血化瘀，抵抗神经氧化损伤的功能使神经元的损伤在一定程度上得到修复[6-8]。通过观察联合用药（丙泊酚+三七）来治疗TBI 大鼠后的NSS 评分及CSEP 电生理检测发现其与丙泊酚TBI 组在神经损害恢复结果中并无统计学差异的存在（P＞0.05），但在将脑皮质样本经过检测后发现在使用联合用药后丙泊酚TBI 组应有的炎症细胞因子合成释放被抑制的现象消失了，出现了降低后的一个BDNF 升高表达的上调，从而影响其受体 TrkB 升高而上调[9-11]。

只有两者同时上调，才能完美结合，发挥BDNF 的生物学神经营养的作用[12]。